Vikipedi

Enzim ölçümü: Revizyonlar arasındaki fark

Etkileşimli olarak geçmişe göz at
[kontrol edilmiş revizyon][kontrol edilmiş revizyon]
← Önceki sürümle aradaki farkSonraki sürümle aradaki fark →
İçerik silindi İçerik eklendi
GörselVikimetin
Peykbot (mesaj | katkılar)
Botlar
463.024 değişiklik
k başlık düzenlemeleri
düzeltme AWB ile
6. satır:
 
=== Enzim aktivitesi ===
Enzim aktivitesi, birim zaman başına dönüştürülen substrat mol sayısına eşittir, bir diğer deyişle reaksiyon hızı çarpı reaksiyon hacmine eşittir. Enzim aktivitesi mevcut aktif enzim miktarının bir ölçüsüdür ve dolayısıyla ''belirtilmesi gereken'' şartları bağlıdır. [[SI]] birimi [[katal]]'dır, 1 katal = 1 &nbsp;mol s<sup>-1−1</sup> (1 &nbsp;mol/saniye)'dir ama bu aşırı büyük bir birimdir. Daha pratik ve yaygın kullanılan bir birim 1 [[enzim birimi]] = (U) = 1 [[μ]]mol min<sup>-1−1</sup>. 1 U, 16.67 [[nano]]katal'a eşittir.<ref>{{Dergi kaynağı|author=Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) |title=Units of Enzyme Activity |journal=Eur. J. Biochem. |volume=97 |pages=319–20 |year=1979 |url=http://www.blackwell-synergy.com/doi/pdf/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x |doi=10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x}}</ref>
 
Katal olarak verilen enzim aktivitesi genelde enzimin doğal hedefi varsayılarak ifade edilir. Enzim aktivitesi bazı standart substratlar cinsinden de verilebilir. Örneğin, [[jelatin]] için ''jelatin sindirim birimleri'' (İngilizce ''gelatin digesting units'' veya GDU) veya süt proteinleri için ''süt pıhtılaştırma birimleri'' (İng. ''milk clotting units'' yani MCU) kullanılır. Bu birimler bir gram enzimin jelatin veya süt proteinleini ne hızla sindireceğini ifade eder. Bir GDU yaklaşık 1,5 MCU'ya eşittir.<ref>[http://www.unc.edu/~rowlett/units/dictG.html How Many? A Dictionary of Units of Measurement] By Russ Rowlett at the University of North Carolina at Chapel Hill</ref>
 
=== Spesifik aktivite ===
Bir enzimin spesifik aktivitesi yaygın kullanılan bir diğer birimdir. Bu, bir enzimin, 1 miligram toplam proteindeki aktivitesidir ve μmol dk<sup>-1−1</sup>mg<sup>-1−1</sup> (mikromol bölü dakika bölü miligram) olarak ifade edilir. Spesifik aktivite enzim aktivitesinin bir ölçüsüdür. Toplam proteinin miligramı başına, belli bir süre zarfında ve belli şartlarda bir enzim tarafından meydana getirilen ürün miktarıdır. Spesifik aktivite reaksiyon hızı çarpı reaksiyon hacmi bölü toplam protein kütlesine eşittir. SI birimi katal kg<sup>-1−1</sup>'dir ama daha pratik bir birim μmol mg<sup>-1−1</sup> dk<sup>-1−1</sup>'dir. Spesifik aktivite enzim [[ilerleyicilik|ilerleyiciliğinin]] bir ölçüsüdür, belli bir substrat konsantrasyonunda (genelde enzimi doyurucu bir konsantrasyon kullanılır) ve saf enzim için genelde sabit bir değerdir. Enzimin saflaştırmasındaki veya diğer faktörlerdeki toplu iş (İng. ''batch'') farklılıklarından kaynaklanan hataları bertaraf etmek için bir aktif bölge titrasyonu yapılması gerekir. Aktif bölge miktarını titre etmek için tersinmez bir enzim inhibitörü kullanılır, böylece aktif enzim miktarı ölçülür. Bu durumda, spesifik aktivite μmol min<sup>-1−1</sup> mg<sup>-1−1</sup> aktif enzim olarak ifade edilmelidir.
 
=== İlgili terminoloji ===
22. satır:
 
* '''İlk hız deneyleri'''. Bir enzim aşırı miktarda bir substrat ile karıştırılınca, geçici bir dönem boyunca enzim-substrat araürünü hızla birikir. Ardından, reaksiyon sabıt durum kinetiğine ulaşır, enzim-substrat araürün konsantrasyonu zaman içinde yaklaşık sabit kalır ve reaksiyon hızı nispeten yavaş değişir. Sabit duruma ulaşıldıktan kısa bir süre sonra reaksiyon hızı ölçülmeye başlanır, genelde zamana bağlı olarak ürünün birikmesi takip edilir. Ölçümler kısa bir süre için yapıldığı ve aşırı konsantrasyonda substrat kullanıldığı için, serbest substrat konsantrasyonun ilk substrat konsantrasyonuna yaklaşık eşit olduğu varsayımı yapılabilir. İlk hız deneyleri yapılması ve analizi en kolay ölçümlerdir, çünkü ters reaksiyon ve enzim yıkımı gibi komplikasyonlardan yoksundur. Bu yüzden enzim kinetik deneylerinde kullanılan en yaygın deneylerden biridir.
 
* '''İlerleme eğrisi deneyleri'''. Bu deneylerde, kinetik parametrelerin belirlenmesi için, zamana bağlı substrat ve ürün konsantrasyonlarını ifade eden denklemler kullanılır. İlk hızlı dönemin ardından, reaksiyonun dengeye ulaşmasına izin verecek kadar uzun bir süre için, substrat veya ürün konsantrasyonu zamana bağlı olarak kaydedilir. Günümüzde artık pek kullanılmamakla beraber, enzim kinetiği tarihinin ilk dönemlerinde ilerleme eğrisi deneyleri yaygın olarak kullanılırdı.
* '''Geçici kinetik deneyleri'''. Bu deneylerde, ilk hızlı dönem sırasında reaksiyon takip edilir, enzim-substrat araürünü sabit-durum kinetiği dönemine ulaşana kadar. Bu deneyler yukarıda belirtilen diğer iki yöntemden daha zordur çünkü hızlı karıştırma ve gözlemleme yöntemleri gerektirirler. ▼
 
▲* '''Geçici kinetik deneyleri'''. Bu deneylerde, ilk hızlı dönem sırasında reaksiyon takip edilir, enzim-substrat araürünü sabit-durum kinetiği dönemine ulaşana kadar. Bu deneyler yukarıda belirtilen diğer iki yöntemden daha zordur çünkü hızlı karıştırma ve gözlemleme yöntemleri gerektirirler.
 
* '''Relaksasyon deneyleri'''. Bu deneylerde bir enzim substrat ve ürün karışımına bir perturbasyon uygulanır, örneğin sıcaklık, basınç veya pH'de ani bir değişiklik yapılarak, ve denge geri dönüş izlenir. Bu deneylerin analizi için tamamen tersinir reaksiyonun gözününe alınması gerekir. Üstelik, relaksasyon deneyleri mekanistik ayrıntıları nispeten duyarsızdır ve dolayıyla genelde mekanizmanın belirlenmesi için kullanılmaz.
 
Satır 39 ⟶ 36:
[[Mor ötesi spektrofotometresi|Spektrofotometrik]] ölçümlerde, reaksiyonun gidişini izlemek için reaksiyon solüsyonunun ne kadar ışık soğurduğuna bakılır. Eğer ışık görünür bölgede ise, reaksiyonun renginde bir değişiklik görülebilir, bunlara '''kolorimetrik ölçüm''' denir. Bir tetrazolyum boyasının substrat olarak kullanıldığı [[MTT ölçümü]], kolorimetrik ölçüme örnektir.
 
Mor ötesi sıkça kullanılır çünkü [[Nikotinamit adenin dinükleotit|NADH]] ve [[Nikotinamit adenin dinükleotit|NADPH]] gibi çoğu koenzim, indirgenmiş hâllerinde mor ötesini soğurur ama yükseltgenmiş (okside) biçimlerinde soğurmaz. NADH'yi substrat olarak kullanan bir [[oksidoredüktaz]]'in aktivitesini ölçmek için 340 &nbsp;nm dalgaboyundaki mor ötesi soğurmasındaki azalmayı takip edilebilir.<ref>{{Kitap kaynağı|author=Bergmeyer, H.U. |title=Methods of Enzymatic Analysis |publisher=Academic Press |location=New York |year=1974 |pages=2066–72 |volume=4 |isbn=089573236X }}</ref>
 
'''Doğrudan ve kenetli ölçümlerin kıyaslaması'''
Satır 68 ⟶ 65:
Radyometrik ölçümler substratların için [[radyoaktivite]] dahil oluşu veya substrattan ayrılması ölçülür. Bu ölçümlerde en sık kullanılan [[radyoaktif izotop]]lar <sup>14</sup>C, <sup>32</sup>P, <sup>35</sup>S ve <sup>125</sup>I'dir. Radyoaktif izotoplar bir substratın tek bir atomunun spesifik işaretlenmesine izin verdiği için, bu ölçümler hem çok duyarlı hem de spesifiktir. Biyokimyada sıkça kullanılırlar ve kaba lizatlarda (yani bir hücre parçalandığı zaman elde edilen karmaşık enzim karışımlarında) spesifik bir reaksiyonun izlenmesinin çoğu zaman tek yoludur.
 
Bu yöntemlerde radyoaktivite genelde [[sintilasyon sayacı]] ile ölçülür.
 
=== Kromatografik ===
Kromotagrafik ölçümlerde, reaksiyon karışımı [[kromatografi]] yoluyla bileşenlerine ayrıştırılıp ve ürün miktarı belirlenir. Genelde bunun için [[yüksek performansli sivi kromatografisi]] kullanılır ama daha basit bir teknik olan [[ince tabaka kromatografisi]] de kullanılabilir. Bu yaklaşım için çok miktarda malzeme gerekse de, substrat veya ürünler radyoaktif veya floresan etketle işaretlenerek duyarlılık artırılabilir. Daha yüksek basınçta çalışan kromatografi araçlarının kullanımıyla da ölçüm duyarlılığı artırılabilir (bakınız [[yüksek basınçlı sıvı kromtagorafisi#Pompa_basıncıPompa basıncı]]).<ref>{{Dergi kaynağı|author=Churchwella, M; Twaddlea, N; Meekerb, L; Doergea, D. |title=Improving Sensitivity in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry |journal=Journal of Chromatography B |volume=825 |issue=2 |pages=134–143 |year=2005 |month=October }}</ref>
 
== Ölçümlerde kontrol edilecek faktörler ==
Satır 78 ⟶ 75:
* '''pH etkileri''': Çoğu enzim [[pH]]'ye duyarlıdır ve belli bir pH aralığında etkinlik gösterir. Hepsinin ptimum bir pH'si vardır. Aşırı pH değerlerinde iyonik bağlar ve hidrojen bağlarının kırılır, bunun sonucu enzimin üç boyutlu yapısı değişir (denatüre olur) ve enzim aktivitesi durur. Çoğu enzim pH 6 ilas 8'de çalışır; ancak, midede bulunan pepsin en iyi pH 2'de, tripsin ise en iyi pH 8'de çalışır.
* '''Substrat doyumu''': Substrat konsantrasyonunu artırmak reaksiyon hızını (enzim aktivitesini) artırır. Ancak, enzimin doyumu reaksiyon hızını sınırlar. Tüm enzim moleküllerinin aktif bölgesi hemen hep dolu olduğu zaman enzimin doymuş olur. Doyum noktasına ulaşılınca artık ne kadar daha çok substrat eklenirse eklensin reaksiyon daha çok hızlanmaz. Reksiyon grafiği plato yapar.
 
*'''Kalabalıklık derecesi''': Çözeltideki yüksek miktarda [[makromolekül]] olması, [[makromoleküler kalabalıklaşma]] adı verilen bir etki ile, enzim reaksiyonlarının [[reaksiyon hızı]]nı ve [[denge sabiti|denge sabitlerini]] etkiler.<ref name=Minton>{{Dergi kaynağı|author=Minton AP |title=The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media |journal=J. Biol. Chem. |volume=276 |issue=14 |pages=10577–80 |year=2001 |pmid=11279227 |doi=10.1074/jbc.R100005200}}</ref>
 
Satır 91 ⟶ 87:
 
<!--{{Protein yöntemleri}}-->
 
[[Kategori:Protein yöntemleri]]
[[Kategori:Enzimler]]
"https://tr.wikipedia.org/wiki/Enzim_ölçümü" sayfasından alınmıştır