Kalsiyum görüntüleme

Bilimsel metot

Kalsiyum görüntüleme tekniği hücre, doku ya da ortamdaki kalsiyum (Ca2+) durumunu görüntülemek amacıyla kullanılan bir bilimsel teknik. Kalsiyum görüntüleme teknikleri floresan özelliği taşıyan, fakat Ca2+ ile bağlandığında floresan özelliği değişen kalsiyum belirteçlerinden faydalanır. İki temel tip kalsiyum belirteci mevcuttur: kimyasal belirteçler ve genetik olarak kodlanmış belirteçler. Kalsiyum görüntüleme, canlı hayvanlarda hücre içi kalsiyumu optik olarak görüntülemek için kullanılabilir.[1] Bu teknik geniş çapta hücre tipinin ve sinir devrelerindeki yüzlerce gliya hücrelerinin ve sinir hücrelerinin sinirsel aktivite görüntüleme çalışmalarına izin verir.

Kimyasal belirteçlerDüzenle

Kimyasal belirteçler kalsiyum iyonları ile şelat oluşturabilen küçük moleküllerdir. Tüm bu moleküller BAPTA olarak bilinen EGTA homoloğunu magnezyum (Mg2+) iyonlarına karşı yüksek kalsiyum (Ca2+) seçiciliğini temel alır.

Bu gruptaki göstergeler fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Kalsiyum Yeşil-1'i içerir.

Bu boyalar sık sık asetoksimetil ester olarak maskelenen şelatör karboksil gruplar ile kullanılır, böylece molekül lipofilik olur ve hücreye girişi kolaylaşır. Bu haldeki belirteç hücreye girdikten sonra hücresel esterazlar karboksil grupları serbest bırakır ve belirteç kalsiyuma bağlanabilir. Boyaların serbest asit formu (asetoksimetil ester modifikasyonu olmayan hali) mikroelektrot veya mikropipet yardımıyla hücrelere doğrudan enjekte edilebilir, böylece hücrelerin hangi bölümünün boya tuttuğuyla ilgili belirsizlikler giderilebilir (asetoksimetil ester ayrıca endoplazmik retikulum ve mitokondriye de girer). Ca2+ iyonunun floresan belirteci moleküle bağlanması floresanın kuantum veriminde artışa ya da ışıma/uyarım dalga boyunda kaymaya sebep olur. Tekil kimyasal Ca2+ floresan belirteçleri çeşitli hücresel hazırlıklarda sitozolik kalsiyum ölçümleri için kullanılır. İlk gerçek zamanlı (video hızı) Ca2+ görüntülemesi 1986 yılında kalp hücrelerinde yoğun video kameralar kullanılarak gerçekleştirilmiştir.[2] Tekniğin bir sonraki gelişiminde lazer tarayıcılı konfokal mikroskoplar kullanılarak hücre altı Ca2+ sinyallerinin Ca2+ kıvılcımları ve Ca2+ biplemesi ürettiği ortaya çıkmıştır. Kimyasal Ca2+ floresan belirteçlerin kombinasyonundan alınan göreceli yanıtlar ayrıca mitokondri gibi hücre içi organellerdeki geçici kalsiyum miktarını belirlemek için kullanılmıştır. [3]

Kalsiyum haritalama olarak da bilinen kalsiyum görüntüleme, ayrıca miyokardiyal doku üzerinde araştırma yapmak için de kullanılır.[4] Kalsiyum haritalama bütün olarak fare, sıçan ve tavşan gibi türlerin izole kalpleri üzerinde uygulanabilen bir tekniktir.

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum belirteciDüzenle

Bu belirteçler, yeşil floresan protein (GFP) veya onun türevlerinin (örneğin dairesel değiştirilmiş GFP, YFP, CFP), kalmodulin (CaM) ve CaM'e bağlanabilen miyozin hafif zincir kinazın M13 etki alanı ile iç içe geçmesi ile türetilmiş floresan proteinlerdir. Alternatif olarak, GFP türevleri kalsiyum bağlayıcı protein troponin C (TnC) ile iç içe geçer ve FRET (Förster Rezonans Enerji Transferi) mekanizmasını sinyal modülasyonu amacıyla kullanır. 

Genetik olarak kodlanmış belirteçlerin hücreler üzerine yüklenmesine gerek yoktur, bunun yerine bu proteinleri okuyan genler kolayca hücre hatlarından hücre içine alabilir. Ayrıca boyanın tüm hücrelerde gösterilmesini ya da seçici olarak belli hücre alt tiplerinde gösterilmesini sağlayan transgenik hayvanların üretimi de mümkündür. GECIler nöron,[5] T-hücreleri,[6] kardiyomiyositler,[7] vb. çalışmalarda kullanılmaktadır.

GECİ Yıl Algılama Raporlama Öncü
Cameleons[8] 1997 Kalmodulin FRET çifti: BFP veya CFP ve GFP veya YFP -
FIP-CBSM[9] 1997 Kalmodulin FRET çifti: BFP ve RFP -
Pericams[10] 2000 Kalmodulin cpGFP -
GCaMP[11] 2000 Kalmodulin cpEGFP -
TN-L15[12] 2004 Değiştirilmiş tavuk kası troponin C FRET çifti: YFP (Sitrin) ve CFP (Cerulean) -
TN-humTnC 2004 İnsan kardiyak troponin C FRET çifti: YFP (Sitrin) ve CFP (Cerulean) -
TN-XL[13] 2006 Değiştirilmiş tavuk kası troponin C FRET çifti: sırası değiştirilmiş YFP (Sitrin) ve CFP (Cerulean) TN-L15
TN-XXL[14] 2008 TN-XL modifiye csTnC FRET çifti: sırası değiştirilmiş YFP (Sitrin) ve CFP (Cerulean) TN-XL
Twitch'in[15] 2014 Troponin C FRET çifti (değişik iki FP) -

KullanımıDüzenle

Belirteç türü ne olursa olsun görüntüleme prosedürü genellikle çok benzerdir. Belirteçle yüklü ya da GECI durumunda gösteren hücreler floresan mikroskobu ile gözlemlenebilir ve bir CCD kamera ile kaydedilebilir. Konfokal ve iki fotonlu mikroskoplar geliştirilmiş kesit alma yeteneği sağlayabilir, böylece kalsiyum sinyalleri mikro etki alanında ya da (örneğin) sinaptik butonlarda çözümlenebilir. Görüntüler floresan yoğunluğu değişimlerinin tek ya da çift dalgaboyunda oransal olarak (oransal belirteçler) gösterdiklerinin ölçülmesiyle analiz edilir. Türetilmiş floresan yoğunlukları ve oranları, bilinen Ca2+ düzeylerinin kalibre edilmiş oranlarına karşı çizilir ve Ca2+ konsantrasyonu öğrenilir. Işık alan mikroskopi yöntemleri[16] 3D birimlerde sinirsel aktivite kapasitesinin fonksiyonel okunumuna kadar genişler.

KaynakçaDüzenle

  1. ^ Stosiek, Christoph; Garaschuk, Olga; Holthoff, Knut; Konnerth, Arthur (2003). "In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks". Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12). ss. 7319–24. Bibcode:2003PNAS..100.7319S. doi:10.1073/pnas.1232232100. JSTOR 3139475. PMC 165873 $2. PMID 12777621. 
  2. ^ Cannell, M. B.; Berlin, J. R.; Lederer, W. J. (1 Ocak 1987). "Intracellular calcium in cardiac myocytes: calcium transients measured using fluorescence imaging". Society of General Physiologists Series. Cilt 42. ss. 201–214. ISSN 0094-7733. PMID 3505361. 
  3. ^ Ivannikov, Maxim V.; Macleod, Gregory T. (2013). "Mitochondrial Free Ca2+ Levels and Their Effects on Energy Metabolism in Drosophila Motor Nerve Terminals". Biophysical Journal. 104 (11). ss. 2353–61. doi:10.1016/j.bpj.2013.03.064. PMC 3672877 $2. PMID 23746507. 
  4. ^ Jaimes, Rafael; Walton, Richard D.; Pasdois, Phillipe Lionel Claude; Bernus, Olivier; Efimov, Igor R.; Kay, Matthew W (2016). "A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue". American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. Cilt 310. ss. ajpheart.00665.2015. doi:10.1152/ajpheart.00665.2015. PMID 27016580. 
  5. ^ Kavalchuk, Yury; Homma, Ryota; Liang, Yajie; Maslyukov, Anatoliy; Hermes, Marina; Thestrup, Thomas; Griesbeck, Oliver; Ninkovic, Jovica; Cohen, Lawrence B. (19 Şubat 2015). "In vivo odourant response properties of migrating adult-born neurons in the mouse olfactory bulb". Nature Communications. Cilt 6. s. 6349. doi:10.1038/ncomms7349. ISSN 2041-1723. PMID 25695931. 
  6. ^ Mues, Marsilius; Bartholomäus, Ingo; Thestrup, Thomas; Griesbeck, Oliver; Wekerle, Hartmut; Kawakami, Naoto; Krishnamoorthy, Gurumoorthy (1 Haziran 2013). "Real-time in vivo analysis of T cell activation in the central nervous system using a genetically encoded calcium indicator". Nature Medicine. 19 (6). ss. 778–783. doi:10.1038/nm.3180. ISSN 1546-170X. PMID 23685843. 
  7. ^ Shinnawi, R; Huber, I; Maizels, L; Shaheen, N; Gepstein, A; Arbel, G; Tijsen, A; Gepstein, L (2015). "Monitoring human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with genetically encoded calcium and voltage fluorescent reporters". Stem Cell Reports. 5 (4). ss. 582–596. doi:10.1016/j.stemcr.2015.08.009. PMC 4624957 $2. PMID 26372632. 
  8. ^ Miyawaki, A.; Llopis, J.; Heim, R.; McCaffery, J. M.; Adams, J. A.; Ikura, M.; Tsien, R. Y. (28 Ağustos 1997). "Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin". Nature. 388 (6645). ss. 882–887. doi:10.1038/42264. ISSN 0028-0836. PMID 9278050. 
  9. ^ Romoser, V. A.; Hinkle, P. M.; Persechini, A. (16 Mayıs 1997). "Detection in living cells of Ca2+-dependent changes in the fluorescence emission of an indicator composed of two green fluorescent protein variants linked by a calmodulin-binding sequence. A new class of fluorescent indicators". The Journal of Biological Chemistry. 272 (20). ss. 13270–13274. ISSN 0021-9258. PMID 9148946. 
  10. ^ Nagai, T.; Sawano, A.; Park, E. S.; Miyawaki, A. (13 Mart 2001). "Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6). ss. 3197–3202. doi:10.1073/pnas.051636098. ISSN 0027-8424. PMC 30630 $2. PMID 11248055. 
  11. ^ Nakai, J.; Ohkura, M.; Imoto, K. (1 Şubat 2001). "A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein". Nature Biotechnology. 19 (2). ss. 137–141. doi:10.1038/84397. ISSN 1087-0156. PMID 11175727. 
  12. ^ Heim, Nicola; Griesbeck, Oliver (2 Nisan 2004). "Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin C and green fluorescent protein". The Journal of Biological Chemistry. 279 (14). ss. 14280–14286. doi:10.1074/jbc.M312751200. ISSN 0021-9258. PMID 14742421. 
  13. ^ Mank, Marco; Reiff, Dierk F.; Heim, Nicola; Friedrich, Michael W.; Borst, Alexander; Griesbeck, Oliver (1 Mart 2006). "A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change". Biophysical Journal. 90 (5). ss. 1790–1796. doi:10.1529/biophysj.105.073536. ISSN 0006-3495. PMC 1367327 $2. PMID 16339891. 
  14. ^ Mank, Marco; Santos, Alexandre Ferrão; Direnberger, Stephan; Mrsic-Flogel, Thomas D.; Hofer, Sonja B.; Stein, Valentin; Hendel, Thomas; Reiff, Dierk F.; Levelt, Christiaan (1 Eylül 2008). "A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging". Nature Methods. 5 (9). ss. 805–811. doi:10.1038/nmeth.1243. ISSN 1548-7091. PMID 19160515. 
  15. ^ Thestrup, Thomas; Litzlbauer, Julia; Bartholomäus, Ingo; Mues, Marsilius; Russo, Luigi; Dana, Hod; Kovalchuk, Yuri; Liang, Yajie; Kalamakis, Georgios (1 Şubat 2014). "Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes". Nature Methods. 11 (2). ss. 175–182. doi:10.1038/nmeth.2773. ISSN 1548-7105. PMID 24390440. 
  16. ^ Pégard, N.; Liu, H.; Antipa, N; Gerlock, M.; Adesnik, H.; Waller, L. (2016). "Compressive light-field microscopy for 3D neural activity recording". Optica. Cilt 3. ss. 517–524. 

Konuyla ilgili yayınlarDüzenle