Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real time-PCR), sekansa özgüllüğü sebebiyle yaygın olarak kullanılan hızlı ve hassas bir gen niceleme yöntemidir. Real Time-PCR yönteminde, tüp içerisinde hızlı şekilde başlangıç deoksiribonükleik asit (DNA) miktarının milyon kat artırılması hedeflenmektedir [1]. Klasik PCR yönteminde, amplifiye edilen DNA ürünü, bir uç nokta analizinde saptanmaktadır. Buna karşılık Real Time-PCR’de amplifikasyon ürününün birikimi, reaksiyon ilerledikçe gerçek zamanlı olarak her döngüden sonra ölçülebilmektedir. Günümüzde spesifik DNA'yı ölçmek için hassas yöntemlerden olan Real Time-PCR, tek bir molekülü de belirleyebilmektedir. Bu doğrultuda, Real Time-PCR yöntemi klasik yöntemlere kıyasla daha düşük miktarlarda karmaşık biyolojik materyaller aracılığıyla çeşitli hastalıkların teşhisinde kullanılmaktadır [2].

"RT-PCR" kısaltması, genel olarak ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonunu belirtir ve gerçek zamanlı PCR'yi değil, ancak tüm yazarlar bu sözleşmeye uymaz[3]

Real Time-PCR AşamalarıDüzenle

Real Time-PCR, ribonükleik asidin (RNA) tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters transkriptaz bağımlı dönüşümü, cDNA'nın PCR kullanılarak amplifikasyonu ve gerçek zamanlı amplifikasyon ürünlerinin tespiti olmak üzere üç aşamadan oluşmaktadır [4].

Denatürasyon EvresiDüzenle

Denatürasyon evresi, yüksek sıcaklıkta inkübasyon ile çift sarmallı DNA'yı tek sarmallar halinde yıkarak tek sarmallı DNA'daki ikincil yapıyı gevşetmeyi hedeflemektedir. Bu evrede kullanılan bir enzim olan DNA polimerazın dayanabileceği en yüksek sıcaklık genellikle 95 °C’dir [5].

Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması (Annealing) EvresiDüzenle

Bu evre, primerlerin ortamda bulunan hedef DNA komponenti ile birleşmesini ve tekrar ayrıştırma olayını kapsamaktadır. Annealing evresi sırasında, tamamlayıcı dizilerin hibritleşme olasılığından kaynaklı primerlerin hesaplanan erime sıcaklığına (Tm) (primerin Tm'sinin 5 °C altında) dayalı uygun bir sıcaklık kullanılmaktadır.

Primer Uzaması EvresiDüzenle

70-72 °C'de, DNA polimeraz uyarımı optimal seyrederek primer uzaması saniyede 100 baza kadar ulaşabilen hızda gerçekleşmektedir [6].

 
RT-PCR Yönteminin Aşamaları

Real Time-PCR ProsedürleriDüzenle

RNA önce miktar ve bütünlük açısından izole edilmektedir. Tek adımlı bir reaksiyon gerçekleştiriliyorsa RNA, Real Time-PCR testi için bir şablon olarak kullanılarak test sırasında ters transkripsiyon işlemi gerçekleştirilmektedir. İki aşamalı bir reaksiyon sırasında, cDNA önce sentezlenerek bir PCR şablonu olarak kullanılmaktadır. Ek olarak, Real Time-PCR cihazında gerçekleştirilen bu adımlar, analiz için kullanılan çıktı verilerini oluşturmak için ham floresan verilerinin toplandığı ve düzenlendiği süre boyunca mavi olarak gösterilir. Floresan verilerinin normalleştirme faktörüne bölünmesi ile normalleştirilmiş veriler üretilerek bu verilerin istatistiksel analizi gerçekleştirmektedir [7].

Real Time-PCR Yönteminin Avantajları ve DezavantajlarıDüzenle

Gerçek zamanlı PCR, hemen hemen aynı dizilere sahip haberci RNA'lar (mRNA'lar) arasında ayrım yaparak diğer gen ifade analizi yöntemlerinden daha az RNA şablonu gerektirmektedir. Ek olarak, bu yöntemde uygun ekipman sağlandığında nispeten yüksek verim elde edilmektedir. Buna karşılık, Real Time-PCR’nin en büyük dezavantajı ise pahalı ekipman ve reaktifler gerektirmesidir [8]. Bu yöntemle çok az miktarda RNA ile oluşan mesajlar saptanarak ifadeleri belirlenebilmektedir. Ek olarak, oluşan Real Time-PCR ürünleri klonlamada vektör olarak kullanılabilir. Bu bağlamda, bu ürünlerden cDNA kütüphaneleri oluşturularak gen kütüphanelerinde değerlendirilmektedir. Real Time-PCR, diğer RNA analiz yöntemlerinden olan RNA hibridizasyonu ile kıyaslandığında daha hassas, hızlı, güvenilir ve kolay bir yöntemdir [9].

RT-PCR Yönteminin Uygulama AlanlarıDüzenle

KanserDüzenle

Kanser, hücre döngüsü, DNA onarımı ve büyüme sinyali genlerinde kalıtsal polimorfizm, mutasyon ve/veya germ hattı olmayan polimorfizm birikiminden kaynaklanabilmektedir [10]. Bu bağlamda, Real Time-PCR yöntemi, kanser araştırmalarında tercih edilebilmektedir [11][12]. İnsidansı yüksek olan kanserlerin çoğunluğu, Real Time-PCR yönteminde işaretleyici gen ifadeleri ölçülerek veya problar kullanılarak gözlemlenmektedir [13].

Tıbbi BilimDüzenle

Kişiselleştirilmiş tıp yolunda, hastalar benzer ilaç etkilerine sahip insan ırkları veya belirli bir seti taşıyan herhangi bir popülasyon grubu, genetik sınıflandırma ile tanımlanabilmektedir. Bu bağlamda sınıflandırma, hastayı kategorize ederek bir hasta için doğru ilaç oranını artırabilmektedir [14]. Bu doğrultuda, advers ilaç reaksiyonları önemli bir morbidite ve mortalite nedenidir. Bu vakaların çoğu, çevresel değişkenlerden güçlü bir şekilde etkilenen klinik fenotip ifadelerdeki değişikliklerle ilişkili görülmektedir [15]. Bu bağlamda, Real Time-PCR yönteminin diğer moleküler tekniklerle birlikte uygulanması, terapötik müdahalenin ve ilaçlara verilen bireysel tepkilerin izlenmesini sağlayabilmektedir [16].

VirolojiDüzenle

Real Time-PCR yöntemini kullanan araştırmalar, viral enfekte olan insan örneklerinden virüsleri tespit etmek veya ölçmek için bu yöntemden yararlanmaktadır. İnsan hastalıkları ile ilgili virüsleri tespit etmek ve ölçmek için Real Time-PCR protokollerinin kritik öneme sahip olduğu ifade edilmiştir [17]. Literatürde viral bir hastalık olan herpeks simpleks virüsü 1 (HSV1) ve herpeks simpleks virüsü 2'nin (HSV2) tespiti, kantitatif PCR'nin özgüllüğünü artırmak için tasarlanmış hidroliz probları olan TaqMan probları aracılığıyla RT-PCR yönteminde sağlanabilmektedir [18]. Ek olarak, HSV DNA polimeraz genini hedefleyen primerler ve problar aracılığıyla HSV1 ve HSV2 genotipleri arasında tespit, kantifikasyon ve farklılaşma elde edilebilmektedir. Bu bağlamda, Real Time-PCR multipleks testleri, viral genotip farklılaşması için gelişmiş bir rol oynamaktadır [19][20].

COVID-19Düzenle

Nükleik asit amplifikasyon testleri, şüpheli hastadan elde edilen numunedeki varlığı tanımlamak için patojenin spesifik nükleik asit dizilerini hedefleyen moleküler testlerdir. Literatürde, enfekte vakaların rutin olarak doğrulanması ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) saptanması için nükleik asit amplifikasyon testlerinden Real Time-PCR yöntemi önerilmektedir. SARS-CoV-2 patolojisinde, Real Time-PCR gibi nükleik asit amplifikasyon testleri, şüpheli hastanın solunum yolundan nükleokapsid (N) geni, zarf (E) geni, S geni ve RNA'ya bağımlı RNA polimeraz geni gibi spesifik viral genleri hedef almaktadır [21].

KaynakçaDüzenle

  1. ^ "Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions". Russell Higuchi, Carita Fockler, Gavin Dollinger, Robert Watson. Bio/technology, 11(9): p. 1026-1030. 1993. 19 Haziran 2020 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  2. ^ "Quantitative real-time PCR for cancer detection: the lymphoma case". Anders Ståhlberg, Neven Zoric, Pierre Aman, Mikael Kubista. Expert Rev Mol Diagn, 5(2): p. 221-30. 2005. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  3. ^ Real-time PCR : current technology and applications. Julie Logan, Kirstin Edwards, Nick Saunders. Norfolk, UK: Caister Academic Press. 2009. ISBN 978-1-904455-39-4. OCLC 227931709. 
  4. ^ "Heid, C.A., et al., Real time quantitative PCR." Christian A. Heid, Junko Stevens, Kenneth J. Livak, P. Mickey Williams. Genome research, 6(10): p. 986-994. 1996. 21 Mayıs 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  5. ^ "Molecular and Biochemical Investigations of Sorgoleone Biosynthesis". D. Cook, F. E. Dayan, A. M. Rimando, Z. Pan, S. O. Duke. Recent Advances in Phytochemistry, 40: p. 157-178. 2006. 21 Mayıs 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  6. ^ "Molecular diagnostic PCR handbook". Viljoen, G. J., L.H. Nel, J. R. Crowther. Springer science & business media. 2005. 21 Mayıs 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  7. ^ "Real-time PCR for mRNA quantitation". Marisa L. Wong, Juan F. Medrano. Biotechniques, 39(1): p. 75-85. 2005. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  8. ^ "Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology". Smith, C. J., Osborn, A. M. FEMS microbiology ecology, 67(1), 6–20. 2009. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  9. ^ "Quantitation of low abundance mRNAs in glial cells using different polymerase chain reaction (PCR)-based methods". S. Santagati, M. Garnier, P. Carlo, E. Violani , G. B. Picotti, A. Maggi. Brain Res Brain Res Protoc, 1(3): p. 217-23. 1997. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  10. ^ "The cancer genome". Michael R. Stratton, Peter J. Campbell, P. Andrew Futreal. Nature, 458(7239), 719–724. 2009. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  11. ^ "Real-time PCR in the microbiology laboratory". I.M. Mackay. Clin Microbiol Infect, 10(3): p.190-212. 2004. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  12. ^ "Molecular approaches in pediatric oncology". Chand Khanna, Lee J. Helman. Annu Rev Med, 57: p. 83-97. 2006. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  13. ^ "Rapid detection of VHL exon deletions using real-time quantitative PCR". Jasmien Hoebeeck, Rob van der Luijt, Bruce Poppe, Els De Smet, Nurten Yiğit, Kathleen Claes, Richard Zewald , Gert-Jan de Jong, Anne De Paepe, Frank Speleman, Jo Vandesompele. Lab Invest, 85(1): p. 24-33. 2005. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  14. ^ "Pharmacogenetics and personalised medicine". Werner Kalow. Fundam Clin Pharmacol, 16(5): p. 337-42. 2002. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  15. ^ "Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics". Giovanni Severino, Maria Del Zompo. Pharmacol Res, 49(4): p. 363-73. 2004. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  16. ^ "Pharmacogenetics and pharmacogenomics: origin, status, and the hope for personalized medicine". W. Kalow. Pharmacogenomics J, 6(3): p. 162-5. 2006. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  17. ^ "Advances in real-time PCR: application to clinical laboratory diagnostics". Bernhard Kaltenboeck, Chengming Wang. Adv Clin Chem, 40: p. 219-59. 2005. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  18. ^ "Rapid detection of herpes simplex virus and varicella-zoster virus infections by real-time PCR". Manfred Weidmann, Ursula Meyer-König, Frank T Hufert. J Clin Microbiol, 41(4): p. 1565-8. 2003. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  19. ^ "Real-time PCR quantification of genital shedding of herpes simplex virus (HSV) and human immunodeficiency virus (HIV) in women coinfected with HSV and HIV". Jérôme Legoff, Hicham Bouhlal, Gérard Grésenguet, Helen Weiss, Nzambi Khonde, Hakim Hocini, Nathalie Désiré, Ali Si-Mohamed, Jean de Dieu Longo, Cécile Chemin, Eric Frost, Jacques Pépin, Jean-Elie Malkin, Philippe Mayaud, Laurent Bélec. J Clin Microbiol, 44(2): p. 423-32. 2006. 21 Mayıs 2021 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  20. ^ "Rapid and sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis of infections by influenza a and influenza B viruses, respiratory syncytial virus, and parainfluenza viruses 1, 2, 3, and 4". Kate E. Templeton, Sitha A. Scheltinga, Matthias F. C. Beersma, Aloys C. M. Kroes, Eric C. J. Claas. J Clin Microbiol, 42(4): p. 1564-9. 2004. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021. 
  21. ^ "Diagnosis of COVID-19 for controlling the pandemic: A review of the state-of-the-art". Nastaran Taleghani, Fariborz Taghipour. Biosensors Bioelectronics:p.112830. 2020. Erişim tarihi: 17 Mayıs 2021.