Yüksek performanslı sıvı kromatografisi: Revizyonlar arasındaki fark

 

Polar analitler, polar sabit faz ile ilişkili sabit bir su tabakasında dağılır ve böylece buraya tutunur. Polar analit ve polar sabit faz (mobil faza göre) arasındaki etkileşimler ne kadar güçlü olursa, elüsyon süresi de o kadar uzun olur. Etkileşim mukavemeti, daha fazla polarize olan grupla (örn., Hidroksil-) ve daha fazla tutunma sağlayan hidrojen bağlayabilen gruplarla, analit moleküler yapısının fonksiyonel gruplar kısmına bağlıdır. Kulombik (elektrostatik) etkileşimler de tutunmayı artırabilir. Mobil fazda daha fazla polar çözücünün kullanılması analitlerin alıkonma süresini azaltırken, daha hidrofobik çözücüler alıkoyma sürelerini artırma eğilimindedir.

Normal faz kromatografisi, kimyagerlerin geliştirdiği ilk HPLC türlerinden biriydi. Normal fazlı HPLC (NP-HPLC) olarak da bilinen bu yöntem, analitleri, silika gibi bir polar sabit faza olan ilgilerine dayanarak ayırır, bu nedenle analitin polar etkileşimlere (hidrojen bağı veya dipol- dipol etkileşimler) ile sabit faz arasindaki etkileşim önemli bir rol oynar. NP-HPLC, apolar, sulu olmayan bir mobil faz (örn., Kloroform) kullanır ve apolar çözücülerde kolayca çözünür olan analitlerin ayrılması için de etkili bir yöntemdir. Analit, polar sabit faza tütünür aynı adsorbsiyon gözlenir. Adsorpsiyon kuvvetleri, artan analit polaritesi ile artar. Etkileşim gücü, sadece analit molekülünün yapısında bulunan fonksiyonel gruplara değil, aynı zamanda sterik etkiye de bağlıdır. Sterik engellemenin etkileşim gücü üzerindeki etkisi, bu yöntemin yapısal izomerleri ayırmasını sağlar.

 

 

Son zamanlarda, partisyon kromatografisi, iyi tekrarlanabilirlik göstermesi, tekniğin kullanışlılığının daha iyi anlaşılması ve yeni HILIC sabit fazlarinin geliştirilmesi ile yeniden popüler hale gelmiştir.

 

Yer değiştirme kromatografisinin temel prensibi şöyledir: Kromatografi matrisi (yer değiştirici) için yüksek afiniteye sahip bir molekül, bağlanma bölgeleri için etkili bir şekilde rekabet eder ve böylece az afinite gosteren diger molekuller ile yer değiştirir. Yer değiştirme ve elüsyon kromatografisi arasında belirgin farklılıklar vardır. Elüsyon modunda, maddeler tipik olarak dar, Gaussian piki şeklinde kromatogramda gözlenir. Maksimum saflaştırma elde etmek için piklerin, tercihen taban çizgisinde geniş bir şekilde ayrılması arzu edilir. Bir karışımın herhangi bir bileşeninin elüsyon modunda kolondan aşağıya inme hızı birçok faktöre bağlıdır. Ancak iki maddenin farklı hızlarda hareket etmesi ve çözülmesi için, biyomoleküller ve kromatografi matrisi arasındaki bazı etkileşimlerde önemli farklılıklar olmalıdır. Tekniğin çalışma parametreleri, bu farkın etkisini en üst düzeye çıkarmak için ayarlanır. Birçok durumda, piklerin taban çizgisi (ing. baseline) ile ayrılması sadece gradiyen elüsyonu ve düşük kolon yüklemeleri ile gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, özellikle preparatif ölçekte elüsyon modu kromatografisinin iki dezavantajı vardır: Gradiyen çözücü pompalaması nedeniyle operasyonel karmaşıklık ve düşük kolon yüklemeleri nedeniyle düşük verimdir. Yer değiştirme kromatografisi, bileşenlerin “pikler” yerine ardışık saf madde bölgelerine ayrılması nedeniyle elüsyon kromatografisine göre avantajlara sahiptir. Bu işlem, izotermlerin doğrusal olmama özelliğinden yararlandığından, daha büyük bir kolon beslemesi, belirli bir kolon üzerinde, daha yüksek konsantrasyonda geri kazanılan saflaştırılmış bileşenler ile ayrılabilir.

 

Boyut dışlama kromatografisi veya jel filtrasyon kromatografisi olarak da bilinen bu yöntem, parçacıkları moleküler boyut temelinde (parçacıklarin Stokes yarıçapıyla) ayırır. Genellikle düşük çözünürlüklü bir kromatografik yontemdir ve bu nedenle genellikle saflaştırmanın son "cilalama" aşamasına ayrılır. Saflaştırılmış proteinlerin tersiyer yapısını ve kuaterner yapısını belirlemek için de yararlıdır. SEC öncelikle proteinler veya polimerler gibi büyük moleküllerin analizi için kullanılır. SEC, bu küçük molekülleri bir parçacığın gözeneklerinde yakalar. Daha büyük moleküller, gözeneklere girmek için çok büyük oldukları için gözeneklerden geçer. Bu nedenle daha büyük moleküller kolondan daha küçük moleküllere göre daha hızlı akarlar, yani molekül ne kadar küçük olursa tutma süresi de o kadar uzun olur.