Yüksek performanslı sıvı kromatografisi: Revizyonlar arasındaki fark

Ayrışacak veya analizlenecek numune, cihaza çok küçük hacimlerde (tipik olarak mikrolitre seviyesinde) kromatograftaki mobil faz akışına verilir. Akan mobil faz, bu maddeleri kolona taşır. Numunenin içindeki analitler turlerine gore farkli hizlarda hareket ederler ve bu hız farkının belirlenmesinde sabit faz-analit etkileşimi (fiziksel etkileşimler) önemli bir rol oynar. Analitlerin taşınma hızı, analitlerin kimyasal doğasına, sabit fazın (kolon) kimyasal yapısına ve de mobil fazın bileşimine bağlıdır. Analitin kolondan çıkma süresine alıkonma zamanı (genelde RT ile gösterilir) denir. Alıkonma zamanı genelde analizdeki analitin karakterini belirlemede kullanılan önemli bir bilgidir.

 

 

Mobil fazlar incelendiğinde, genel olarak su ve suyla çözünebilen organik bir solvent kullanılır. Bu solventlerden de en yaygın olarak kullanılanları metanol ve asetonitrildir. Bazı HPLC teknikleri içinde suyun bulunnmadığı mobil fazlar da kullanılır (Normal faz sıvı kormatografisi). Genellikle mobil fazın içerisinde formik asit, fosforik asit veya trifloroasetik asit gibi veya bazı tuzlar da eklenir. Bu eklenen kimyasallar kromatografi operasyonuna, yani analitlerin ayrışmasına yardımcı olur. Mobil fazın bileşimi analiz sırasınca sabit tutulabilir ve bu işleme isokratik elüsyon denir. Mobil faz bleşminin zamana bağlı değiştiği analizlere de gradiyent elüsyon denir. İsokratik analizler genellikle kimyasal özellikleri tamamen farklı veya sabit faza farklı derecelerde ilgi gösteren molekkülerin bulunduğu karışımları ayırmada kullanılır. Gradiyent analizlerde analitlerden elüsyon kuvveti az olandan çok olana doğru bir moleküler ayrışma gözlenir. Bi başka deyişle, analitler sabit faza yüksek afinite gösterdiklerinde, sabit fazla daha çok etkileşirler ve kolon içersinde daha çok zaman geçirerek detektöre daha geç ulaşırlar, fakat bazı analitler de sabit fazla fazla etkileşmez ve daha hızlı bir biçimde detektöre ulaşırlar. Bu farklılık, farklı zamanlarda sinyallere neden olur be bu ilgili analitlerin kromatografik pikleri, kromatogramda farklı zamanlarda çıkar. Tipik bir ters faz kromatografi gradiyent analiz %5 asetonitrile ile başlarve doğrusal olarak 5-25 dakika içerisinde, %95'e kadar çıkar. Mobil fazın bileşimin değsımediği periyotlar da analiz profilinde yer alabilir. Örneğin, mobil faz 1-3 dakika boyunca %5 asetonitril seviyesinde kalabilir ve daha sonra doğrusal olarak ilerleyen dakikalarda %95'e çıkabilir.