Enzim ölçümü: Revizyonlar arasındaki fark

'''Enzim ölçümleri''' [[enzim]] aktivitesini ölçmek için laboratuvar yöntemleridir. [[Enzim kinetiği]]ni ve [[enzim inhibitörü|enzim inhibisyonunun]] araştırılması için önemlidirler.

 

Enzim miktarları, diğer kimyasal bileşikler gibi, [[mol]]ar birim ile ifade edilebilir veya aktivite cinsinden [[enzim birimi]] ile ölçülebilir.

 

Enzim aktivitesi, birim zaman başına dönüştürülen substrat mol sayısına eşittir, bir diğer deyişle reaksiyon hızı çarpı reaksiyon hacmine eşittir. Enzim aktivitesi mevcut aktif enzim miktarının bir ölçüsüdür ve dolayısıyla ''belirtilmesi gereken'' şartları bağlıdır. [[SI]] birimi [[katal]]'dır, 1 katal = 1 mol s^-1 (1 mol/saniye)'dir ama bu aşırı büyük bir birimdir. Daha pratik ve yaygın kullanılan bir birim 1 [[enzim birimi]] = (U) = 1 [[μ]]mol min^-1. 1 U, 16.67 [[nano]]katal'a eşittir.<ref>{{Dergi kaynağı|author=Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) |title=Units of Enzyme Activity |journal=Eur. J. Biochem. |volume=97 |pages=319–20 |year=1979 |url=http://www.blackwell-synergy.com/doi/pdf/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x |doi=10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x}}</ref>

 

Katal olarak verilen enzim aktivitesi genelde enzimin doğal hedefi varsayılarak ifade edilir. Enzim aktivitesi bazı standart substratlar cinsinden de verilebilir. Örneğin, [[jelatin]] için ''jelatin sindirim birimleri'' (İngilizce ''gelatin digesting units'' veya GDU) veya süt proteinleri için ''süt pıhtılaştırma birimleri'' (İng. ''milk clotting units'' yani MCU) kullanılır. Bu birimler bir gram enzimin jelatin veya süt proteinleini ne hızla sindireceğini ifade eder. Bir GDU yaklaşık 1,5 MCU'ya eşittir.<ref>[http://www.unc.edu/~rowlett/units/dictG.html How Many? A Dictionary of Units of Measurement] By Russ Rowlett at the University of North Carolina at Chapel Hill</ref>

 

Bir enzimin spesifik aktivitesi yaygın kullanılan bir diğer birimdir. Bu, bir enzimin, 1 miligram toplam proteindeki aktivitesidir ve μmol dk^-1mg^-1 (mikromol bölü dakika bölü miligram) olarak ifade edilir. Spesifik aktivite enzim aktivitesinin bir ölçüsüdür. Toplam proteinin miligramı başına, belli bir süre zarfında ve belli şartlarda bir enzim tarafından meydana getirilen ürün miktarıdır. Spesifik aktivite reaksiyon hızı çarpı reaksiyon hacmi bölü toplam protein kütlesine eşittir. SI birimi katal kg^-1'dir ama daha pratik bir birim μmol mg^-1 dk^-1'dir. Spesifik aktivite enzim [[ilerleyicilik|ilerleyiciliğinin]] bir ölçüsüdür, belli bir substrat konsantrasyonunda (genelde enzimi doyurucu bir konsantrasyon kullanılır) ve saf enzim için genelde sabit bir değerdir. Enzimin saflaştırmasındaki veya diğer faktörlerdeki toplu iş (İng. ''batch'') farklılıklarından kaynaklanan hataları bertaraf etmek için bir aktif bölge titrasyonu yapılması gerekir. Aktif bölge miktarını titre etmek için tersinmez bir enzim inhibitörü kullanılır, böylece aktif enzim miktarı ölçülür. Bu durumda, spesifik aktivite μmol min^-1 mg^-1 aktif enzim olarak ifade edilmelidir.

 

'''Reaksiyon hızı''', birim zaman başına yok olan substrat (veya meydana gelen ürün) konsantrasyonudur (''mol'' <math>L^{-1} s^{-1}</math>).

 

[[Dosya:Cuvette_holder.jpg|thumb|left|Bir spektrofotometrenin sıcaklık kontrollü [[küvet]] haznesi.]]

 

Sürekli ölçümler kullanışlıdır, fazladan bir işleme gerek kalmadan bir ölçüm ile reaksiyon hızı elde edilir. Sürekli ölçümlerin pek çok tipi vardır.

 

[[Mor ötesi spektrofotometresi|Spektrofotometrik]] ölçümlerde, reaksiyonun gidişini izlemek için reaksiyon solüsyonunun ne kadar ışık soğurduğuna bakılır. Eğer ışık görünür bölgede ise, reaksiyonun renginde bir değişiklik görülebilir, bunlara '''kolorimetrik ölçüm''' denir. Bir tetrazolyum boyasının substrat olarak kullanıldığı [[MTT ölçümü]], kolorimetrik ölçüme örnektir.

 

Enzim reaksiyonu ışık soğurmasında bir değişikliğe neden olmasa da, '''kenetli ölçüm''' (İng. ''coupled assay'') kullanılarak enzim için spektrofotometrik bir ölçüm yapılabilir. Burada, bir reaksiyonun ürünü, kolayca izlenebilen başka bir reaksiyonun substratıdır. Örneğin, sağdaki şekilde heksokinaz enzimi için bir kenetli ölçüm gösterilmiştir. Bu enzimin ürettiği glukoz-6-fosfat, [[glukoz-6-fosfat dehidrojenaz]] aracılığıya, NADPH üretimine bağlanır.

 

[[Floresans]], bir molekülün belli bir dalga boyunda ışık soğurduktan sonra başka bir dalga boyunda ışık salmasıdır. Florometrik enzim ölçümlerinde substrat floresansı ile ürün floresansı arasındaki farktan yararlanılır. Bu ölçümler spektrofotometrik ölçümlerden daha duyarlıdır ama bir dezavantajları, [[katışkı]]lardan kaynaklanan enterferans ve çoğu floresan bileşiğin ışığa maruz kalınca bozulmalarıdır.

 

Bu ölçümlerin bir örneği, gnee nükleotit koenzimler [[NADH]] ve [[NADPH]]'nin kullanımıdır. Bu durumda, indirgenmiş (redüklenmiş) biçimler floresandır, yükseltgenmiş (okside) biçimler ise floresan değildir. Dolayısıyla, oksidasyon reaksiyonları floresans azalması ile, redüksiyon reaksiyonları da floreans artması ile izlenebilir.<ref>{{Kitap kaynağı|author=Passonneau, J.V., Lowry, O.H. |title=Enzymatic Analysis. A Practical Guide |publisher=Humana Press |location=Totowa NJ |year=1993 |pages=85–110 }}</ref> Enzim tarafından katalizlenen reaksiyonlarda floresan boya salan sentetik sbstratlar da mevcuttur, [[β-galaktozidaz]] ölçümü için 4-metilumbelliferil-β-D-galactosit gibi.

 

[[Dosya:Luminol2006.jpg|thumb|Luminol'un kemilüminesansı]]

[[Kalorimetri]] kimyasal reaksiyonlarda yayılan veya emilen ısının ölçümüdür. Çoğu reaksiyon bir ısı değişimine yol açtığı için bu yöntem çok genel amaçlıdır. Bir mikrokalorimetre kullanılırsa ölçüm için az miktarda enzim veya substrat yeterlidir. Başka yolla ölçülemeyen reaksiyonlar bu ölçüm yöntemi ile takip edilebilir.<ref>{{Dergi kaynağı|author=Todd MJ, Gomez J |title=Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity? |journal=Anal. Biochem. |volume=296 |issue=2 |pages=179–87 |year=2001 |month=September |pmid=11554713 |doi=10.1006/abio.2001.5218 }}</ref>

 

[[Kemilüminesans]], bir kimyasal reaksiyon sonucu ışık salınmasıdır. Bazı enzim reaksiyonları ışık üretirler ve bu yolla ürün oluşumu ölçülebilir. Bu tip ölçümler çok duyarlı olabilir çünkü üretilen ışık fotoğraf filmi kullanılar günler veya haftalar boyunca yakalayabilir, ama nicelenmesi zor olabilir, çünkü salınan ışığın tamamı tespit edilmez.

 

Enzimatik kemilüminesans ile peroksidaz tespiti, [[Western blot]] ile antikorların tespiti için yaygın olarak kullanılır. Bir diğer örnek, [[ateş böceği|ateş böceklerinden]] elde edilen [[lusiferaz]] enzimidir; bu enzim, substratı olan lusiferin ile reaksiyona girince ışık salar.

 

[[Statik ışık saçılımı]] çözeltideki makromoleküllerin ağırlıklı molar kütlesi ile konsantrasyonlarının çarpımını ölçer. Saçılım sinyali, ölçüm sırasında, bir veya birkaç kimyasalın belli bir sabit toplam konsantrasyonu için, çözeltideki tüm bileşiklerin molar kütlesinin ağırlıklı hesaplanmış doğrudan ölçümüdür. Kompleksler oluştukça veya ayrıştıkça bu değer değişir. Dolayıyla bu ölçüm ile komplekslerin stokyometresi ve kinetiği nicelenir. Protein kinetiğinin ışık saçılımı ile ölçümü, enzim gerektirmeyen çok genel bir yöntemdir.

 

Süreksiz ölçümlerde, bir enzim reaksiyonundan düzenli aralıklarla numuneler alınır ve bunlardaki ürün oluşumu veya substrat tüketimi ölçülür.

 

Radyometrik ölçümler substratların için [[radyoaktivite]] dahil oluşu veya substrattan ayrılması ölçülür. Bu ölçümlerde en sık kullanılan [[radyoaktif izotop]]lar ¹⁴C, ³²P, ³⁵S ve ¹²⁵I'dir. Radyoaktif izotoplar bir substratın tek bir atomunun spesifik işaretlenmesine izin verdiği için, bu ölçümler hem çok duyarlı hem de spesifiktir. Biyokimyada sıkça kullanılırlar ve kaba lizatlarda (yani bir hücre parçalandığı zaman elde edilen karmaşık enzim karışımlarında) spesifik bir reaksiyonun izlenmesinin çoğu zaman tek yoludur.

 

Bu yöntemlerde radyoaktivite genelde [[sintilasyon sayacı]] ile ölçülür.

 

Kromotagrafik ölçümlerde, reaksiyon karışımı [[kromatografi]] yoluyla bileşenlerine ayrıştırılıp ve ürün miktarı belirlenir. Genelde bunun için [[yüksek performansli sivi kromatografisi]] kullanılır ama daha basit bir teknik olan [[ince tabaka kromatografisi]] de kullanılabilir. Bu yaklaşım için çok miktarda malzeme gerekse de, substrat veya ürünler radyoaktif veya floresan etketle işaretlenerek duyarlılık artırılabilir. Daha yüksek basınçta çalışan kromatografi araçlarının kullanımıyla da ölçüm duyarlılığı artırılabilir (bakınız [[yüksek basınçlı sıvı kromtagorafisi#Pompa_basıncı]]).<ref>{{Dergi kaynağı|author=Churchwella, M; Twaddlea, N; Meekerb, L; Doergea, D. |title=Improving Sensitivity in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry |journal=Journal of Chromatography B |volume=825 |issue=2 |pages=134–143 |year=2005 |month=October }}</ref>

 

*'''Tuz konsantrasyonu''': Çoğu enzim çok yüksek tuz konsatrasyonuna dayanamaz. Iyonlar, proteindeki zayıf [[iyon bağı|iyon bağlarına]] etki eder. Tipik enzimler 1-500 mM tuz konsantrasyonları arasında çalışır. Tabii ki, halofilik (tuz seven) yosun ve bakterilerin enzimleri gibi istisnalar mevcuttur.

*'''Sıcaklık Etkileri''': Tüm enzimler ait oldukları organizmaya has sıcaklık aralığında çalışır. Sıcaklığın artırılması genelde reaksiyon hızında artışa yol açar. Ancak belli bir optimumun üstünde sıcaklığın yükselmesi reaksiyon hızını azaltır, çünkü enzim aktif bölgesinin üç boyutlu yapısını stabilize eden [[iyonik bağ]]lar ve [[hidrojen bağı|hidrojen bağları]] kopmaya başlar.<ref>{{Dergi kaynağı|author=Daniel RM, Peterson ME, Danson MJ, ''et al.'' |title=The molecular basis of the effect of temperature on enzyme activity |journal=Biochem. J. |volume=425 |issue=2 |pages=353–60 |year=2010 |month=January |pmid=19849667 |doi=10.1042/BJ20091254}}</ref> İnsan enzimlerinde optimum sıcaklık genelde 35 ila 40&nbsp;°C'dır. İnsan enzimleri 40&nbsp;°C'ın üstünde hızla denatüre olmaya başlar. Sıcak su kaynaklarında (kaynarcalarda?) bulunan termofilik arkekerin enzimleri 100&nbsp;°C'ye kadar stabildir.<ref>{{Dergi kaynağı|author=Cowan DA |title=Thermophilic proteins: stability and function in aqueous and organic solvents |journal=Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. |volume=118 |issue=3 |pages=429–38 |year=1997 |pmid=9406427 |doi=10.1016/S0300-9629(97)00004-2}}</ref> Ancal, bir enzim için "optimum" bir hız olduğu fikti yanıltıcıdır çünkü belli bir sıcaklıkta gözlemlenen hız aslında iki sıcaklığın çarpımıdır, reaksiyon hızı ve denatürasyon hızı. Eğer bir saniye için enzim aktvitesi ölçesiniz yüksek sıcaklıkta daha yüksek bir hız bulabilirsiniz ama ürün oluşumunu bir saat boyunca ölçseniz, yüksek sıcaklıkta daha az ürün oluştuğunu bulursunuz.

*'''Kalabalıklık derecesi''': Çözeltideki yüksek miktarda [[makromolekül]] olması, [[makromoleküler kalabalıklaşma]] adı verilen bir etki ile, enzim reaksiyonlarının [[reaksiyon hızı]]nı ve [[denge sabiti|denge sabitlerini]] etkiler.<ref name=Minton>{{Dergi kaynağı|author=Minton AP |title=The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media |journal=J. Biol. Chem. |volume=276 |issue=14 |pages=10577–80 |year=2001 |pmid=11279227 |doi=10.1074/jbc.R100005200}}</ref>

 

*[[Enzim kinetiği]]

 

{{kaynakça}}

 

* [http://openwetware.org/wiki/IGEM:IMPERIAL/2009/Assays_Protocols OpenWetWare]