|
'''Lipaz''', [[yağ]]ların parçalanmasından sorumlu [[enzim]] grubu. Bir lipaz, suda çözünebilen bir enzimdir ve [[lipit]]lerin [[ester bağ]]larının [[hidroliz]]ini [[kataliz]]e eder.
'''Mikrobiyal Lipazlar : Gelecek Endüstrisinin Potansiyel Biyokatalizörleri'''
Günümüzde lipazlar hem sulu hem de susuz ortamda yapılması güç reaksiyonları başaran en önemli biyokatalizörler arasında yer almaktadır. Bu, her şeyden önce, onların geniş bir substrat spektrumunu kullanabilme, aşırı sıcaklıklara, pH ve organik çözücülere ve kemorejiyo ve enantiyoselektiviteye karşı kararlılık gösterebilme yetenekleri sayesinde olmaktadır. Kısa bir zaman önce lipazların üç boyutlu yapılarının belirlenmesiyle eşsiz yapı-fonksiyon ilişkileri aydınlatılmıştır. Bitki, hayvan ve mikrobiyal lipazların arasında çok geniş uygulama alanı bulan lipazlar, mikrobiyal lipazlardır. Bunun sebebi, mikropların kolay yetiştirilebilmeleri ve lipazlarının çeşitli hidrolitik ve sentetik birçok reaksiyonu katalizleyebilmeleridir. Lipazlar, gıda ve süt ürünleri (peynir olgunlaştırma, aroma geliştirme, EMC teknololjisi), deterjan, ilaç sanayisi (naproxen, ibuprofen), tarımla ilgili kimyasal madde ( insektisit, pestisit), ve oleokimyasal (katı-sıvı yağ hidrolizleri, biyolojik yüzey aktif madde sentezleri) endüstrileri gibi çeşitli biyoteknolojik alanlarda kullanılmaktadır. Lipazlar, potansiyel biyokatalizör olarak kullanıldıkları daha birçok yeni alanda başarıyla görev almaktadırlar.
Endüstriyel enzimler, ,çok çeşitli proseslerde uygulanabilmelerinden dolayı özellikle mikrobiyal kökenli olanlar için gelen talep sürekli artmaktadır. Enzim ortamlı reaksiyonlar, alternatifleri olan yorucu ve pahalı kimyasal reaksiyonlardan daha caziptir. Enzimler, gıda, süt ürünleri, ilaç sanayisi , deterjan, tekstil ve kozmetik endüstrileri gibi birçok alanda kullanılmaktadır.Üstteki senaryoda, proteaz ve amilazlar gibi enzimler,proteinler ve karbohidratlar için hidrolitik reaksiyon
larının olması sebebiyle dünya pazarına egemen olmuşlardır. Bununla birlikte, son beş on yılda
mikrobiyal lipazların biyokatalitik potansiyellerinin sulu ve susuz ortamda anlaşılmasıyla, son derece önemli çeşitli reaksiyonlar için faydalanma yönünde endüstriyel tavırlar değişmiştir.
Son on yılda lipazlar, özellikle organik sentez alanında, proteazlar ve amilazlar üzerinden kesinlikle büyük bir önem kazanmıştır. Lipazların doğal enantiyoselektivite ve rejiyoselektivitesinden, şiral ilaçların çözümlenmesi, yağ modifikasyonu, bitkisel yağ yerine kullanılan maddelerin sentezi, biyolojik yakıtların sentezi, kişisel bakım ürünlerinin sentezi ve aroma artırıcıların sentezi için yararlanılmaktadır. Bu nedenle lipazlar, günümüzde, organik kimyacıların, eczacıların, biyofizikçilerin, biyokimya ve proses mühendislerinin, biyoteknologların, mikrobiyolog ve biyokimyacıların enzim seçimidir. Lipazlar (triaçilgliserol, açilhidrolazlar ) serin hidrolazları sınıfı içinde yer alır ve bu nedenle hiçbir kofaktöre ihtiyaç duymazlar. Lipazların doğal substratları olan triaçil gliseroller, suda çok düşük çözünürlüğe sahiptir. Doğal şartlar altında lipazlar, çözünmeyen bir substratlı faz ile enzimin erimediği sıvı faz arasındaki arabirimde bulunan ester bağlarının hidrolizini katalizler. Bazı deneysel şartlar altında, örneğin su yokluğunda, reaksiyonu tersine çevirebilmektedirler. Ters çevirme reaksiyonları, esterifikasyon ve yağ asitleri ile gliserolden gliseridlerin oluşmasına yol açar. Substrat ve sıvı faz arasındaki bir arabirim üzerinde lipaz reaksiyonunun oluşu, reaksiyonun kinetik analizi ve denemede zorluklara neden olur. Alışılmış endüstriyel lipazlar, katı ve sıvı yağlar üzerine etki eden, ve onların başlangıçta gliserid ve yağ asitlerinin yerine konulan maddeler için hidrolize ederler ve son olarak gliserol ve yağ asitlerinin toplam hidrolizlerini gerçekleştirirler.
Şekil 1: Bir lipaz molekülünün ana özelliklerini gösteren diagram. Substrat herhangi bir trigliserid olabilir
Doğada lipazlar, reaksiyonlarının özgüllüklerinde önemli ölçüde çeşitlilik gösteren türlü kaynaktan elde edilebilmektedir : bu özellik genellikle enzim özgüllüğü olarak ifade edilmektedir. Bu nedenle, yağ asitlerinin bulunduğu taraftan bazı lipazlar kısa zincirli yağ asitlerine (asetik, bütirik, kaprik, kaproik, kaprilik vs.) afinite gösterirler; diğer birçok lipazlar özgül değilken ve yağ asitlerini trigliseridlerden rastgele ayırırken bazıları ayrılmamış yağ asitlerini (oleik, linoleik, linolenik vs.) tercih ederler. Lipazlar,trigliseridlerin gliserol taraflarından sıkça pozisyonel özgüllük gösterirler ve gliserolün 1 veya 3 pozisyonundaki karbonu üzerinde bulunan yağ asitlerine veya her iki pozisyonda ve yağ asiti dışında gliserol molekülünün 2 pozisyonundaki karbonuna etki eder.Bununla birlikte açil grubunun rastgele uzaklaştırılması sayesinde, monogliserid olan 2 pozisyonundaki yağ asidini gliserol molekülünün 1 veya 3 pozisyonundaki yağ asidini iterek yeniden düzenlenir; açil grubunun uzaklaştırılması yavaş bir işlemdir ve mevcut lipazlar gliserolün 2-mono yağ asit esterlerinin üzerine etki etmez, hidroliz yavaşlar ve gliseride 1 ve/veya 3 no’lu pozisyondan lipazın etki etmesini kolaylaştırmak için açil grubunun uzaklaşmasının tamamlanmasını bekler.İlginçtir ki, lipazlar su-yağ arabiriminde işlev görür (Şekil 2). Mevcut yağ miktarı, arabirimdeki lipaz aktivitesini belirler. Bu arabirim alanı, çalkalama gibi emülsifiye edicilerin kullanımıyla doygunluk sınırına kadar önemli ölçüde artırılabilir. Doygunluk sınırı, içeriği oluşturan maddelerin fiziksel şartlarının dağılımına bağlıdır. Bu nedenle denebilir ki, emülsiyon misellerinin ebadının büyütülmesi gibi emülsifiye edici ajanların kullanımıyla, lipazların aktiviteleri artırılabilir.
Şekil 2. Su-yağ arabiriminde lipolitik reaksiyon
Lipazlar hiçbir anabolik proseste yer almazlar. Bu enzimin su-yağ arabirimine etki etmesi bilindiğinden beri önemli endüstriyel bileşiklerin hazırlanması için bir katalizör olarak kullanılmaktadır. Lipazlar, trigliseridlerin digliseridlere, monogliseridlere, gliserol ve yağ asitlerine hidrolizlerini katalizler ve belirli şartlar altında ters reaksiyonla gliserol ve yağ asitlerinden gliseridlerin oluşumu ile esterifikasyonu yönetir. Lipazlar ester bağlarına etki ettiği için, yağların ayrıştırılmasında, interesterifikasyonda (transesterifikasyon) peynirde farklı aromaların geliştirilmesinde, köpek maması yapımı için biftek yağının tadının değiştirilmesinde vs. kullanılmaktadır. Günümüz uygulamalarından biri, organik asit ve alkollerden farklı değerlerde eklenmiş esterlerin sentezi için susuz organik çözücüler için lipazların kullanımını gerektirmektedir. Bazik pH’da ,8’den 11’e kadar denebilir, kararlı olan ve çalışan, enzimli-toz ve sıvı deterjanlar için yıkama şartlarına uygun olan lipazlar bulunmaktadır ve bunlar deterjan endüstrisinde kullanılmak için iyi bir potansiyele sahiptirler
Araştırmalar, bitki, hayvan ve mikrobiyal lipazların bilhassa bakteriyel ve fungal lipazların üzerinde uygulanmaktadır. Her ne kadar pankreatik lipazlar alışılageldiği gibi çeşitli maksatlar için kullanılsa da, şimdi mikrobiyal lipazların çok yönlü özellikleri, kolay nesil vermeleri, ve sınırsız gereçlerin olmasından dolayı ticari uygulamlarda tercih edildikleri kabul edilmektedir.
'''Bakteriyel Lipazlar'''
Küçük bir grup akraba bakteriyel lipazlar üzerinde bitki ve fungal lipazları karşılaştırmak için iyice çalışılmıştır. Bakteriyel lipazlar glikoprotein yapısındadırlar, fakat bazı hücre dışı bakteriyel lipazlarsa lipoprotein yapısındadırlar. Winkler et al. çoğu bakteride enzim üretiminin bazı polisakkaritler tarafından etkilendiğini bildirmiştir. Şimdiye kadar çoğu bakteriyel lipazların yapıcı ve substratlarına karşı özgül olmadığı ve az bir kısım bakteriyel lipazların da ısıya karşı dayanıklı olduğu bildirilmiştir.
Bakteriler arasından, Achromobacter sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., ve Chromobacterium sp.’den lipaz üretiminde faydalanılmaktadır.Stafilolokokkal lipazlar doğada lipoprotein yapısında bulunurlar. S. aureus ve S. hyicus’tan saflaştırılan lipazlar yaklaşık olarak 34-46 kDa ağırlığındadırlar. Bu lipazlar, Ca iyonu tarafından uyarılır ve EDTA tarafından inhibe edilirler. Optimum pH 7,5-9,0 arasında değişir. S. hyicus ve S. aureus’un lipaz genleri klonlanmış, sekans analizleri yapılmış ve diğer lipazlarla karşılaştırılmıştır. Aktif tarafı oluşturan yapıya benzeyen 100 amino asitle ayrılmış muhafazalı bu iki saha da ortaya çıkarılmıştır. S. hyicus lipazının His 269 ve Ser 369 amino asitlerinin etrafında olduğu varsayılan aktif taraflar, yüksek ölçüde S. aureus lipazlarında ve çeşitli ökaryotik lipazlarda muhafaza edilmektedir.
Farklı Pseudomonas türlerinden elde edilen lipazlar, süpernatant kültüründen asidifikasyonla, amonyum sülfat çöktürmesiyle, sefaroz CL-6B kromatografisiyle ve CHAPS kullanılarak izoelektrik odaklama ile saflaştırılmıştır. P.fragi, P. fluorescens ve P. aeruginosa sırasıyla 33 kDa, 45 kDa ve 29 kDa ağırlığında olup monomerik yapıdadırlar. Lipazlar , Zn, Fe ve Al iyonları tarafından aktive edilir ve Ca iyonu tarafından inhibe edilir. P. fragi’nin lipaz geni klonlanmış ve sekans analizi yapılmıştır.
'''Fungal Lipazlar'''
Fungal lipazlar üzerinde 1950’lerden beri çalışılmaktadır ve Lawrence , Brockerhoff ve Jensen kapsamlı görüşler sunmuşlardır. Bu lipazlar, düşük maliyetli soy verme özelliklerinin olması, ısıya ve pH’ya karşı dayanıklı olmaları, substrat özgüllüğü ve organik çözücülerde aktif olmalarından dolayı kullanılmaktadırlar. Ticari lipazların başlıca üreticileri Aspergillus niger, Candida cylindracea, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus ve R. oryzae türleridir.
'''Fungal Lipazların Taksonomik Dağılımları'''
Palmiye yağının lipidlerinin niteliğini bozan lipazlar Turner tarafından araştırılmıştır ( Lazer ve Schroder tarafından bahsedilmiştir, Stzajer ve Zboinska tarafından listelenmiştir). Mucorales arasından,Mucor hiemalis,M. miehei, M. lipolyticus, M. pusillus, Rhizopus japonicus R. arrhizus,R. delemar, R. nigricans, R. nodosus, R. microsporus ve R. Chinesis’in lipolitik enzimleri detaylı bir şekilde çalışılmaktadır. Termofilik olan M. pusillus, ısıya dayanıklı bir hücre dışı lipaz üreticisi olarak iyi bilinmektedir. M. miehei’nin lipaz üreten bir ırkından, izoelektrik yönlerden küçük farklarla ayrılan fakat yüksek derecede antijenik tanımlama gösteren iki izoenzim izole edilebilmiştir. Bir reçine (Lipozim TM) üzerinde immobilize olan M. miehei’nin bir lipazı, Novo Endüstrileri tarafından pazarlanmaktadır.
Rhizopus’un 1,3-(rejiyo)-spesifitesinin olmasından dolayı, özellikle monogliseridlerinin yerini tutan trigliseridlere dönüşümü için uygun olan ve katı-sıvı yağlar arasında interesterifikasyon reaksiyonlarına uygun olan lipazlar, gıda ve ilaç sanayisinde uygulamalara sahiptirler. R. japonicus lipazı, palmiye yağının metil sitratla interesterifikasynu ile çikolata imalatı için uygun olan tereyağı üretiminde kullanılmaktadır. Çeşitli Rhizopus türlerinin lipazları (40’tan 45 kDa’ya kadar olanlar) orta-zincirli yağ asitlerine karşı maksimum aktivite gösterir. R. delemar’ın hücre dışı ve hücre içi lipaz enzimleri izole edilmektedir.
Entomophthorales cinsleri içinde lipaz üreticileri olarak Entomophthora apiculata, E. Coronata, E. thaxteriana, E. virulenta, Basidiobolus spp. ve Conidiobolus spp. sıralanabilir. Pichia, Hansenula ve Saccharomyces cinslerinin de lipaz ürettikleri bildirimiştir. Saccharomyces lipolytica’dan iki çeşit hücre bağlayıcı lipaz saflaştırılmıştır. Candida curvata, C. tropicalis, C. valida ve C. pelliculosa’dan elde edilen lipazların, C. deformans’ın hariç olmasıyla birlikte, trigliseridlerdeki farklı ester bağlarına karşı nonspesifik oldukları bildirimiştir.
Kusurlu mantar Geotrichum candidum, yağın lipoliziyle süt ürünlerinde asit oluşumundan sorumludur. G. candidum lipazı, yağ asitlerine karşı 9. karbonda bir cis çift bağı oluşturma özelliğine sahiptir, bundan dolayı trigliseridlerin yapısal analizleri için kullanılmaktadır.
Aspergillus niger’in hücreler arası ve hücre dışı lipazları 1,3-(rejiyo)-spesifiktirler. A. oryzae’nin, Rhizopus miehei ve Humicola lanuginosa lipazlarının heterolog durumlarında marifetli bir konakçı olduğu bildirilmiştir.Penicillium roqueforti‘nin lipazı, Mavi Peynir’in aromasını vermekten sorumludur. Brie ve Camembert peynirlerinin beyaz yüzlü küflü taraflarından, P.camemberti’de de lipolitik aktivite varlığı belirlenmiştir. Bütirik asit için özgüllük gösteren lipazlar, Penicillium cyclopium, P. verrucosum var. cyclopium ve P.crustosum gibi Penicillium türlerinden izole edilmektedir. P. cyclopium lipazı, di-monogliseridlere karşı trigliseridlerden daha yüksek aktiviteye sahiptirler. H. lanuginosa DSM 3819’un lipazı, ısıya dayanıklılığı, bazik pH’da yüksek aktivitesi ve anyonik yüzey aktif maddelere karşı dayanıklılığı sayesinde bir deterjan katkı maddesi olarak kullanılmaya uygundur. H. lanuginosa lipazları, Hindistan cevizi yağı ve fazla miktarda laurik asit içeren yağlarla,yüksek derecede bir hidrolitik aktivite gösterirler.bu iki lipaz,pozisyonel spesifiteleriyle birbirlerinden ayrılırlar.
'''Lipaz Üretimi'''
Lipidler suda çözünmezler ve eğer hücre için besleyici olarak işlev görürlerse, emilimi kolaylaştırmak için daha fazla kutuplu parçalarına hücre dışında yıkılmaları gerekmektedir. Bu yüzden, lipazların çoğu hücre dışında muhafaza edilmektedir.
'''Yetiştirme Parametrelerinin Optimizasyonu'''
Raporların bir sayısında, sıcaklık, pH, nitrojen, karbon ve lipid kaynakları, çalkalama ve çözünmemiş oksijen konsantrasyonu gibi çeşitli çevresel faktörlerin lipaz üretiminde etkili oldukları bulunmuştur. Lipaz üretimi genellikle lipidler tarafından uyarılmaktadır. Lipaz aktivitesi sürekli olarak bir pik yapıncaya kadar artar ve azalır. Lipaz üretimi genellikle trigliseridlerin varlığına bağlıdır ve onlarla düzenlenir. Bundan başka, serbest yağ asitleri, hidrolizlenebilen esterler, safra tuzları ve gliserol de lipaz üretimini uyarabilir. P. fragi kullanımıyla pepton ilaveli ortamda yüksk lipaz üretimi olur, bununla birlikte farklı peptonlar etkinliklerini değiştirirler. Her ne kadar Pseudomonas türleri amonyum sülfatlı, glukozlu, sitratlı veya pirüvatlı bazal bir ortamda gelişirse de, lipaz üretimi için organik bir nitrojen kaynağına ihtiyaç duyarlar. Lipaz üretimi için arjinin, lisin ve glutamik asit karışımlı bir ortamın etkin olduğu gözlenmiştir. Penicillium roqueforti’nin bir ırkı, % 0,5 casitone ve % 1 proflobroth içeren bir ortamda yetiştirildiğinde maksimum miktarda lipaz üretmektedir. Micrococcus türlerinin yetiştirilmesi ve lipaz üretimi %0,5’ten %2’ye kadar olan pepton miktarından etkilenmemiştir, fakat Pseudomonas türleri, A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans ve M. racemus türleri tarafından yapılan lipaz üretimi peptonla uyarılmaktadır. Rhizopus oligosporus’un kültür ortamına eklenen soya fasülyesi ekstraktı, iyi gelişme ve üretim sağlamıştır. Kesikli, yarı kesikli ve sürekli kültür ortamlarında çeşitli şartlar altında, P. aeruginosa’nın termotolerant bir ırkı tarafından yapılan lipaz üretimi, nitratın genellikle lipaz üretimini uyardığını desteklemektedir.
Süt, psikotrofik bakterilerin gelişmesi ve glukoz tarafından katabolit represyonuna uğradığı düşünülen lipaz üretimi için iyi bir ortamdır. Halbuki glukoz, P. fragi, A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans ve M. racemosus tarafından yapılan lipaz üretimi için gereklidir. P. aeruginosa EF2 glukoza ihtiyaç duymamaktadır. Lipaz üretimi için Talaromyces emersonii’nin kullanılması halinde, laktoz, mannoz, ksiloz, fruktoz, dekstrin ve ramnozda miselyumun miligram kuru ağırlığı başına düşen lipaz aktivitesi daha fazla olmaktadır. M. racemosus’ta, mannitol, galaktoz, sukroz, fruktoz, laktoz, maltoz, rafinoz veya riboz büyümenin gerilemesine sebep olduğundan, lipaz üretiminin de azalmasına neden olmaktadır. Glikojen, hiyaluronat, laminarin, arap sakızı ve pektin gibi polisakkaritler Serratia marcescens ve Saccharomyces cerevisiae’de lipaz üretimini uyarmaktadırlar. R. japonicus’ta incelendiği üzere, benzer bir mekanizma da lipaz üretiminde lesitinin uyarıcı etkisini açıklamaktadır.
Trigliserid, hem bir indüser hem de bir inhibitör olarak etki edebildiği için lipaz üretiminde önemlidir. Bir trigliserid olan zeytin yağının lipaz indüklenmesinde etkin olduğu gözlenmiştir. P. fragi tarafından yapılan lipaz üretimini ayrışmamış yağ asitlerinin tuzları inhibe etmektedir; halbuki, tribütirin ve trioktanoin P. fragi ve M. freudenreichii tarafından yapılan lipaz üretimi üzerine hiç etki göstermemektedir. Tereyağı, mısır yağı veya zeytin yağı, P. roqueforti, Saccharomycopsis sp., B. licheniformis, M. caseolyticus ve Staphylococcus sp. tarafından yapılan lipaz üretimini inhibe etmektedir. Zeytin yağı, yer fıstığı yağı, pamuk tohumu yağı gibi trigliseridler ve oleik, linoleik ve linolenik asit gibi yağ asitleri P. mephitica tarafından yapılan lipaz üretimini uyarmaktadır.Lipidler doğru indüserler olarak sayılmamaktadırlar. A. wentii, kültür ortamına sentetik ve doğal lipidlerin eklenmesiyle gelişme ve lipaz üretiminde azalma göstermiştir. R. oligosporus’ta, akasya sakızını içeren kültür ortamı iyi bir gelişim ve lipaz üretimini sağlamaktadır. Triolein, zeytin yağı, tribütirin ve oleik asit, immobilize edilmiş protoplastlarda lipazı indükleyebilir, halbuki Tween 80 lipaz aktivitesini artırmaktadır.
Lipaz üretimi için kültür ortamının başlangıç pH’sı daima önemlidir. P. fragi için maksimum aktivitenin pH > 7,0 ve P. aeruginosa için ise pH 9,0’da olduğu görülmüştür, ki onun içinde asiditenin gelişmesiyle kültür ortamında azalan lipaz aktivesi vardır. Bunu aksine, S. lipolytica, M. caseolyticus, B. licheniformis, A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans, Mucor racemosus, R.oligosporus
ve P. aeruginosa EF2 için maksimum lipaz aktivitesinin asidik pH’da (4,0-7,0 ) olduğu bildirilmiştir.
P. fluorescens ve P. fragi tarafından yapılan lipaz üretiminde sıcaklığın 8 C derecenin üstüne çıkarılmasının baskılayıcı bir etki yaptığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, P. fluorescens tarafından yapılan lipaz üretiminin 20 C derecede (ref. 90) ani inaktivasyonu, gizli proteinazlar tarafından eş zamanlı bir şekilde potansiyel olarak bakteriyel lipazları inaktive edebildiklerini ve bu etkinin daha yüksek sıcaklıklardaki ( 30-40 C ) kültür ortamlarında daha fazla olduğunu göstermektedir. Oso, T. emersonii tarafından yapılan lipaz üretimi için 45 C sıcaklığın en iyi sıcaklık olduğunu tespit etmiştir. Bununla birlikte 22-35 C civarındaki sıcaklıkların, A. wentii, M. heimalis, R. nigricans, M. racemosus, R.oligosporus ve P. aeruginosa tarafından yapılan maksimum lipaz üretimi için optimum olduğu gözlenmiştir.
Havalandırma, farklı organizmalar tarafından lipaz üretimi üzerinde çeşitli etkilere sahiptir. Havalandırmanın derecesi, derin olmayan tabaka kültürlerinde (hafif havalandırma), çalkalamalı kültürlere göre ( güçlü havalandırma) daha fazla üretim olduğu için bazı durumlarda önemli olarak görülür. Şiddetli havalandırma çoğunlukla R. oligosporus, P. fragi, P. aeruginosa ve M. racemosus tarafından yapılan lipaz üretimini azalttığından, sabit kültür şartlarında artan lipaz üretiminin olduğu sonucuna varılmaktadır. Bununla birlikte, P. mephitica var. lipolytica, A. wentii ve M. hiemalis tarafından yapılan üretimde yüksek aktivite için güçlü havalandırma gereklidir. Yüzey alanının hacme olan oranının değiştirilmesinden sonra P. fragi kültürlerinde hücre başına düşen lipaz üretiminin üzerinde havalandırmanın hiçbir etkisi olmamıştır, fakat çalkalamayla havalandırmanın artırılması hem gelişimi hem de üretimi birlikte artırmaktadır ve bunu takiben çalkalmanın sürdürülmesiyle lipaz aktivitesinde ani bir azalma meydana gelmektedir. Oso, dengeli şartlar altında T. emersonii’de maksimum lipaz üretiminin sağlandığını bildirmiştir. Row ve Gilmour, lipaz üretiminin erken safhalarında gerçekleşen oksijen geriliminin azalmasından hemen önce, P. fluorescens`ın (psikotrof) iki ırkı tarafından yapılan ve 7 C’de süt ortamını uyaran lipaz sentezinin yapıldığını gözlemiştir. R. delemar tarafından yapılan lipaz üretimi üzerinde oksijen konsantrasyonunun etkisi farklı fermentörler kullanılarak araştırılmaktadır. Giuseppin çalkalamalı erlen kültürlerinde oksijenin sınırlayıcı faktör olduğunu belirtmiştir. O ayrıca düşük oksijen konsantrasyonunun, geçici veya lokal oksijen sınırlamasının meydana geldiği durumlarda fermentasyon prosesinin ölçüsünün azaltılmasında kullanışlı bir faktör olduğunu ve R. delemar metabolizması üzerine olumsuz yönde etki ettiğini bildirmiştir.
'''Lipaz Denemesi'''
Lipazlar, triglseridlerin hidroliziyle serbest yağ asitleri ve gliserollerin oluşumuna yol açmalarıyla bilinmektedirler. Bu yüzden, deney metodları spektrofotometrik veya titrimetrik yöntemleri,radiola zil deneyi, florimetri yüzey gerilim metodu ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC)yöntemiyle serbest yağ asitlerinin tahminini içermektedir. Tribütirin levha deneyi ve titrimetri yöntemi lipaz üreticilerini ve tahmini lipaz aktivitesini görüntülemek için en çok kullanılan yöntemlerdir.
'''Lipaz Saflaştırılması'''
Lipazlar, amonyum sülfat çöktürmesi, jel filtrasyonu ve iyon değiştirme kromatografisi yöntemlerini içeren çeşitli metodlarla hayvansal, bitkisel, fungal ve bakteriyel kaynaklardan saflaştırılmaktadır. Geçen yıllarda, kramatografik teknikler spesifiteyi artırdığı kadar lipaz saflaştırılmasındasaflaştırırken gereken adımların sayısını azalttığı için kullanılmaya başlanmıştır. Genellikle, ters-miseller ve 2 fazlı sistemler, membran prosesleri ve bağışıksal saflaştırma işlemleri, lipazların saflaştırılmasında kullanılmaktadır.
'''Lipaz Özellikleri'''
Araştırılan lipazlar, pH 4’e kadar asidik ve pH 8’e kadar bazik ortamlarda dayanıklı olmalarıyla birlikte, en fazla stabiliteyi pH 6,0-7,5 arasında göstermektedir. A. niger, Chromobacterium viscosum ve Rhizopus türlerinin hücre dışı lipazları asidik pH’da aktiftir. P. nitroreducens’ten izole edilen lipaz ise pH 11,0’de aktivite göstermektedir.
'''Optimal Sıcaklık ve Termal Denge'''
Pankreatik lipazlar stok halindeyken 40 C sıcaklığın üzerinde düşük aktivite gösterirler, fakat bazı mikrobiyal lipazlar sıcaklık inaktivasyonuna daha dayanıklıdırlar. A.niger, R. japonicus ve C. viscosum lipazları 50 C’de dayanıklı olduğu halde, H. lanuginosa ve P. sp. nitroreducens’in termotolerant lipazları ise sırasıyla 60 C ve 70 C sıcaklığa dayanıklıdır. R. japonicus lipazına benzer şekilde, C. gigantea lipazı, 45 C, 50 C ve 55 C sıcaklıklarda inaktivasyonla sırasıyla, 35,7, 46,4 ve 22,9 dakikada yarı ömürlerini tamamlamaktadırlar. Laboratuarımızda A. terreus’tan saflaştırılan lipazın 60 C sıcaklıkta 24 saatin sonunda %100 aktivite sağladığını gözledik; fakat C .gigantea ve mezofillerin diğer lipazları 30-35 C sıcaklıkta maksimum aktivite göstermektedir. İzlanda’nın sıcak ilk baharında elde edilen termofilik bakteriler 40-60 C (ref. 145) sıcaklıkta daha yüksek aktivite göstermektedir.
'''
'''Enzimin aktivasyonu ve inaktivasyonu''''''
Bilinen lipaz aktivitesi gerçekleşmesi için kofaktörlere gerek yoktur. Ca gibi iki değerlikli iyonlar genellikle aktiviteyi uyarmaktadır. Bunun, uzun zincirli yağ asitlerinde kalsiyum tuzlarının formulasyonu üzerinde temellendirildiği kabul edilmektedir. Lipaz aktivitesi,, Co, Ni, Hg ve Sn tarafından kuvvetli bir şekilde; Zn, Mg, EDTA ve SDS tarafından zayıf bir şekilde inhibe edilmektedir. H. lanuginosa S-38’de, dithiothreitol gibi, sülfhidril-indirgeyici ajanlar enzim aktivitesini değiştirmezler, fakat sıcaklık inaktivasyonuna karşı daha hassas hale getirmektedirler. İnaktivasyon ürenin artışıyla hızlanmaktadır. İndirgeyici bileşikler (sistein, 2- merkaptoetanol), EDTA, o- fenantrolin gibi ajanlar ve tiol grubu inhibitörler (p- kloro merkürik benzoat, monoiyodo asetat) M. pusillus’ta lipaz üzerinde hissedilebilir bir etki göstermez, bunun sebebi olarak da, lipazın bir metalo-enzim olmaması ve aktivitesi için serbest bir –SH grubu veya sağlam S-S köprüsüne ihtiyaç duymaması gösterilmektedir. Spantanöz ve siklik AMP tarafından indüklenen lipaz teşekkülü, çoğunlukla, Serratia marcescens SM-6’da glikojen, hiyaluronat, pektin B ve arap sakızının meydana gelmesini artırmaktadır.
'''Substrat Spesifitesi (Özgüllüğü)'''
Lipazların spesifitesi, enzimin moleküler özellikleriyle, substratın yapısıyla ve enzim-substrat bağlantısını etkileyen faktörlerle kontrol edilmektedir. Lipazların substrat spesifitesi, onların analitik ve endüstriyel amaçlar için kullanılabilirlikleri bakımından oldukça önemlidir. Spesifite, substratlarının hem yağlı açil ve hem de alkol gruplarıyla olan ilişkileriyle gösterilmektedir. Birçok mikrop farklı yağ asidi spesifiteleriyle iki veya daha fazla hücre dışı lipaz üretmektedir. Tribütirin, bazı mikroplar tarafından yavaş hidroliz edilmektedir. Bunun aksine, M. miehei lipazı düşük pH’da özellikle süt yağından bütirik asiti ayrıştırmayı tercih eder. Geotrichum candidum, uzun zincirli yağ asitlerine özgü esterlerin hidrolizi için bahsedilen spesifiteyi gösteren bir lipaz üretmektedir. Bu lipazın spesifitesi, Jensen, Jensen ve Pitas ve Macrae tarafından özetlenmiştir. Lipazlar, substratlarının alkol kısımlarıyla ilgili hem rejiyo- hem de streospesifite göstermektedir. Lipazlar, açilgliseroller substratları meydana getiren rejiyospesifiteleri baz alınarak iki gruba ayrılabilir.
Birinci grup lipazlar, reaksiyonda di-monoaçilgliserollerin aracılığıyla triaçilgliserollerin, gliserol ve yağ asitlerine tamamen yıkılmasını katalizler. Bu aracılar, triaçilgliserollerden daha çabuk hidroliz edilebildikleri için birikmezler. Birinci grup lipazlara C. cylindracea lipazı örnek olarak verilebilir.
İkinci grup lipazlar, açilgliserollerin daha dış kısımlarında 1 ve 3. pozisyonlarından rejiyospesifik olrak yağ asitlerini serbest bırakır. Bu lipazlar, serbest yağ asitlerini, 1,2-diaçilgliserolleri ve 2-monoaçilgliserolleri vermesi için hidroliz ederler. A. niger ve R. arrhizus’tan elde edilen lipazlar gibi hücre dışı birçok mikrobiyal lipaz 1,3-(rejiyo)-spesifite göstermektedir. Yine R. japonicus, M. miehei, H. lanuginosa, C. viscosum ve P. flourescens tarafından dışarı atılan lipazlar da 1,3 rejiyo spesifiktirler. Bu tarihe kadar, Asahara et al.’ın ibr raporu hariç, açilgliserollerin merkezindeki 2 pozisyonlu yağ asitlerinin seçici olarak salıverilmelerini katalizleyen lipazlar hakkında güvenilir hiçbir rapor bulunmamaktadır. Triaçilgliserollerin kısmi spesifitesi, R. arrhizus, R. delemar C. cylindracea ve P. aeruginosa’da incelenmektedir. Bu özellikler sayesinde, bu enzimler, doğal esterler ve a alkolleri optikçe izole etmek için kullanılmaktadır.
Triaçilgliserollerin hidrolizinde bahsedilen stereospesifiteye sahip bir hücre dışı lipazın üretimi önemli ölçüde ticari ilgiye sahip olabilir. Çoğu lipazlar, kısmi esterlenmiş esterlere trigliserdlere etki ettiği gibi hızlıca etki eder; fakat P. cyclopium’un özel bir ırkının enzimi monogliseridlere sırsıyla, di-ve trigliseridler etki ederler, ve bu olay kısmi gliserol ester hidrolizi olarak tanımlanmaktadır. Çok çeşitli mikrobiyal lipazlar, daha şimdiden ticari bir şekilde ithal edilmektedir ve hem sıvı hem de katı organik ortamlarda aşağıda belirtildiği gibi, çok geniş sayıda hidrolitik ve sentetik reaksiyonları katalizleme potansiyelleri olduğu için faydalanılmaktadır.
'''Organik Sentezlerde Lipazlar'''
Sentetik kimyasal maddeler için, organik sentezlerde lipazların katalizör olarak kullanılması çok avantajlı bir durumdur. Bu enzimler, stereo ve rejiyo spesifite gösterebilir ve inkübasyon karışımındaki organik çözücüleri tolere edebilirler. Hem enzimin aktivitesi hem de ürünün kimliği, bifazik emülsiyonlar ve mikroemülsiyonlar gibi sıvı tampon sistemlerinden organik çözücülere kadar çeşitlilik gösterebilen çözücülere bağlıdır. Sentetik yüzeyler için işlenmemiş enzim preparasyonları daha kullanışlıdır. Çünkü, kimyasal reaksiyonlarda katalizör her zaman pahalı bir faktördür, enzimlerin geri dönüştürülüp tekrar kullanılması için stratejiler geliştirilmektedir. Mikrobiyal lipazları içeren yapay stratejiler yüksek pozisyonel ve konfigürasyonel saflıkta moleküllerin hazırlanmasında kullanılabilirler.Biyolojik sistemlerde antagonistler ve inhibitörler gibi doğal olarak mesajcı ve moleküllere karşı biyolojik olarak aktif olan analoglar oluşturmak için lipazlar kullanılabilir.
Tablo 1 : Mikrobiyal lipazların özellikleri
Lipazlar, su-yağ arabiriminde trigliseridlerin hidrolizini katalizler.Deneysel şartlar altında, reaksiyon karışımındaki suyun miktarı, reaksiyonun yönünü belirleyecektir. Su yokluğunda veya eser miktarda varlığında transesterifikasyon tercih edilir; aşırı su varlığında ise hidroliz meydana gelmektedir.
Sıvı Ortamlarda Biyolojik Dönüşümler
Ester hidrolizi, lipazların sıvı ortamda katalizlediği tipik bir reaksiyondur. Bu enzimsel dönüşüm platelet aktive edici faktörün hazırlanması için, gösterildiği üzere trigliseridlerin sentezinde kullanılabilir. Lipazların hidrolitik spesifitelerinin diğer bir uygulaması da, biyolojik yönden uygun olan emülsifiyerler ve gıda katkı maddeleri olarak görev yapan di- ve monogliseridlerin, trigliseridlerden kısmi hidrolizidir. Endüstri ve araştırmalarda, bunlar ve lipazların diğer uygulamaları, Iwai ve Tsujisaka tarafından oluşturulan dergide tartışılmaktadır.
Organik ortamda biyolojik dönüşümler
Lipazların organik çözücülerde sentetik potansiyeli, çok geniş bir ölçüde tanımlanmıştır; bilhassa, düşük miktarda su muhtevası içeren organik çözücülerde lipazların aktiviteleri üzerinde olduğu gibi iyi bir şekilde belgelendirilmiştir. Organik kimyada lipazların asıl uygulanma şekilleri, bu enzimlerin enantiyoselektivitelerinin kullanımıyla, enantiyometrik bileşiklerin çözümlenmesidir.Lipazların katalizlediği bir çözümlemede çözücü olarak suyun kullanımına kıyasla, organik çözücülerin kullanımının başlıca 4 avantajı vardır: 1) Alkol ve asitlerin rasemik karışımlarının enantiyomerlerine çözümlenmeden önce esterleştirilmelerine gerek yoktur. 2 ) Bu enzimler suya kıyasla organik çözücülerde daha dayanıklıdırlar. 3 ) Lipazların immobilizasyonu için geri dönüştürülmelerine gerek yoktur. 4 ) Substratlar ve ürünler, su içerikli çözeltilerde dayanıksız olabilirler. Bu durumda, organik çözücülerdeki reaksiyonlar ürünlerin oluşumu ve izolasyonu için gereklidir. Organik çözücülerde lipazların katalizlediği reaksiyonların başlıca üç alanı şunlardır:
1 ) Rasemik alkollerin çözümlenmesi : Rasemik alkoller susuz ortamda C. cylindracea lipazı kullanımıyla bifazik sistemlerde çözülebilir. Kirchner et al. tarafından transesterifikasyon reaksiyonları porsin pankreatik lipazının katalizör olarak kullanılmasıyla dietil eter ve heptanda elde edilmiştir. Transesterifikasyon ayrıca, 3-hidroksiglutarat ve ilgili bileşiklerin , optik bakımdan aktif olan monoesterler gibi yararlı synthon’ların hazırlanmasında da kullanılmaktadır. Sulkatolden saf ve biyolojik olarak aktif olan S- enantiyomer üretimi için ve siklohekzanol yerine kullanılan siyanohidrin bileşikleri ve epoksi esterlerinin transesterifikasyonu için lipazlar kullanılmaktadır.
2 ) Asimetrik esterifikasyonla rasemik asitlerin çözümlenmesi : Karışmayan bifazik sistemlerde rasemik asit karışımlarının çözümlenmesinde lipazların stereoselektivitelerinin kullanıldığı kanıtlanmıştır. C. cylindracea lipazı, fenoksipropiyonik herbisit sentezinin başlangıç materyali olarak kullanılan 2- bromopropiyonik asitlerin ve 2- kloropropiyonik asitlerin çözümlenmesinde uygulanmaktadır. P. fluorescens lipazı, dikarboksilik asitlerin yerine kullanılan proşiral glutarik anhidritlerin asimetrik halkasını açmak için kullanılmıştır. Porsin pankreatik lipazı Gutman ve Brando tarafından proşiral hidroksi diesterlerden stereoselektif laktomizasyonlar ve polikondenzasyonlar için kullanılmıştır. (-) pirenoforin gibi makrosiklik laktonlar, anhidroz izooktanda bulunan (w-1) hidroksialkanoik esterlerden 65 C’de Pseudonmonas türleri tarafından stereoselektif olarak sentezlenebilir.
3 ) Rejiyoselektif açilasyonlar : Lipazların katalizlediği açilasyonlar, basit alkollerle sınırlandırılamaz. Lipazlar ayrıca, belirli steroidlerle, şekerlerle ve monoaçillenmiş şekerler gibi şeker türevleriyle kuvvetli rejiyoselektif açilasyonlar gösterir. Şiral ortamlarda çok yönlü görev alan glikallerde hidroksi grupların rejiyoselektif açilasyonu, lipazlar tarafından katalizlenmektedir. Lipazların güçlü rejiyoselektivitesine diğer bir örnek de, hidroksi steroidlerin sentezi için anhidröz organik çözücülerde gerçekleşen açilasyon reaksiyonlarıdır. Lipazlar; transesterifikasyon (interesterifikasyon da denir), hidroliz ve esterifikasyon olarak adlandırılan başlıca 3 tip reaksiyonun katalizlenmesinde görevlidir. (Şekil 3)
Şekil 3: Lipaz ortamlı çeşitli reaksiyonlar
Transesterifikasyon reaksiyonlarının sonunda elde edilen net enerji sıfırdır, ki bu reaksiyonlar kolaylıkla yapılabilmektedir. Bununla birlikte, diğer iki tip reaksiyon da endüstriyel yönden önemli ölçüde kazanç sağlamaktadır. Özellikle kozmetik endüstrisinde çeşitli katkı maddelerinin sentezinde esterifikasyon oldukça önemlidir; reaksiyon karışımındaki su içeriğinin kontrolüyle reaksiyon gerçekleştirilmektedir.
Lipazlar, trigliseridlerle birlikte inkübe edildiklerinde, gliserid molekülleri arasındaki açil gruplarının uzaklaştırılmasıyla hidroliz ve yeniden sentez olaylarıyla sonuçlanır. Reaksiyon sistemindeki su miktarının kontrol edilmesiyle, hidrolizi azaltmak mümkündür. Tranesterifikasyon reaksiyonları bu yüzden daha baskındır. Eğer nonspesifik bir lipaz kullanılırsa, reaksiyon, yeniden düzenlenmiş trigliseridler, sodyum alkoksidlerin katalizörlüğünde elde edilen kimyasal esterifikasyonla az ya da çok benzerlik gösterir. Bununla birlikte, kimyasal yollarla elde edilemeyen trigliserid karışımları, 1,3-spesifik lipazların kullanımıyla elde edilmektedir.
1,3-spesifik lipazların katalizlediği transesterifikasyon reaksiyonlarından, bitkisel yağ yerine kullanılan maddelerin, daha ucuz orta-kısım palmiye yağı ve sitrik asit yapımlarında faydalanılmaktadır. Palmiye yağının orta-kısmı bitkisel yağ yerine kullanılan başlıca trigliseridler olan 1,3-dipalmitoyl- 2-monoolein (POP) ve ana içeriklerden olan 1-(3)-palmitoyl-3-(1)-stearoyl-2-monoolein (POS) ve 1-(3)-distearyl-2-monoolein (TOS) içermektedir. Bu sayede, POP ile stearic asit arasında veya POP ile tristearin arasında gerçekleşen transesterifikasyon, bitkisel yağa eşdeğer olmaktadır.
Palmiye yağının orta-kısmı, n-hekzan yağlarının çift katlı fraksiyonuyla elde edilir. Orta-kısmın transesterifikasyonu; orta-kısmın bir parçasının suyu ayrıştırılmış n-hekzan (2,8’den 3 parçaya kadar) içerisinde çözülmüş 0,7 parça stearic asit ve 0,1 parça celite-immobilize olmuş lipazın (Sigma’dan Rhizopus arrhizus lipazı) 37 C sıcaklıkta 20 saatlik kullanımı ile gerçekleştirilmiştir. Transesterlenmiş ürünlerin düzenlenişi, bitkisel yağın düzenlenişine çok yakındır. Ayçiçeği ve yalancı safran (aspur) tohumu yağları Japonya’da bitkisel yağ yerine kullanılan maddelerin üretiminde kullanılmaktadır.
Katı ve sıvı yağların, saf ya da immobilize formda bulunan ya da hücreye bağlı halde bulunan lipazlar tarafından hidroliz edilmesiyle hakkında çok geniş hacimli literatürler bulunmaktadır. Hidroliz reaksiyonları, normal emülsiyon sistemlerinde gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, hidroliz reaksiyonları henüz, alışılmış colgate-zımpara proseslerinin yerine kullanılmamaktadır. Normal kimyasal proseslerle lipazların katalizlediği yağ ayrıştırma prosesleri enerji maliyeti açısında birbirine denk değildir. Bununla birlikte, örneğin, Candida cylindracea lipazının sıvı yağları ayrıştırmada kullanılması gibi, bazı şirketler lipazları sabun yapımında kullanmaktadır. Enzimatik yollarla üretilen sabunların daha iyi renk ve kokuya sahip oldukları ve enerji maliyetinin de daha az olduğu iddia edilmektedir. Yüksek oranda ayrışmamış ya da bileşik halde bulunan yağ asitlerini içeren sıvı yağlar enzimatik hidroliz reaksiyonlarında bilhassa kullanılmaktadır. Genellikle, membran biyoreaktörleri veya içi boş fiber reaktörlerinin kullanılmasıyla sıvı yağların yağ asitlerine sürekli hidrolizinin incelenmesi, araştırmaların odağında yer almaktadır. Hassas yağ asitlerinin özel gruplarının geniş ölçekli üretimi için artan yüksek enerji maliyeti veya gerekli malzemeler yönünden enzimatik yağ ayrıştırma işlemleri, endüstriyel bakımdan önemli kazanç sağlayacaktır.
Alkolizis işlemleri gibi lipazların katalizlediği sentezler arasından esterlerin imalatı da endüstriyel önem kazanmaktadır. Yüksek saflıkta bulunan çok çeşitli esterler kozmetik endüstrisinde kullanmak için üretilmektedir. Kısa-zincirli yağ asitlerinden üretilen esterler, gıda sanayisinde aroma verici maddelerin yapımında uygulamalara sahiptir; ayrıca uzun-zincirli yağ asitlerinden üretilen metil veya etil esterler de dizel yakıtlar için potansiyel bir uygulamaya sahip olmalarına karşın, esterlerin çoğu bu reaksiyonların kullanımı sonunda ticari önemi olan ve doğal yollarla oluşan balmumlarına benzemektedir. Uzun-zincirli yağ asitleri ve uzun-zincirli yağ alkolleri balmumlarına izafeten kullanılmaktadır; çoğu esterlerin kilogram-ölçülü sentezleri Olivercrona ve Bengtsson tarafından
tanımlanmıştır. Lipazların katalizlediği esterler, düşük su konsantrasyonunun teminine ihtiyaç duymaktadır. Mevcut kaynaklar, su konsantrasyonundaki % 0,75’ten % 4’e kadar olan bir değişikliğin farklı tipte ester sentezine sebep olduğunu göstermektedir. Bu durumun, hekzan gibi su içermeyen çözücülerin kullanımıyla gerçekleştiğine inanılmaktadır.
Ayrıca bazı lipazlar, alkolleri selektif olarak esterleştirirler. Bu nedenle, geraniol ve nerolden oluşan bir karışım hekzan içerisinde esterleştirmeye maruz bırakıldığında Novo Nordisk’in Rhizopus arrhizus lipazı selektif olarak asetat esterine dönüştürür. Böylece, hekzan içerisinde asetik asitle karıştırılmış, her biri 0,1 M olan geraniol ve nerol arasındaki reaksiyon ile 2 günde toplam esterlerin % 80’i geraniol asetat olarak ve kalan % 20’si de nerol asetat olarak üretilmiştir. laboratuar ölçüm çalışmaları geranil bütiratın sentezi için % 1 w/v’lik bir enzim dozunun hekzanda reaktant olarak 0,1 M geraniol ve 0,1 M bütirik asitin kullanımıyla 30 C sıcaklıkta 1,5 gün sonra hemen hemen % 100 dönüşüm verdiğini bildirmektedir.
'''Uygulamalar'''
Günümüz endüstrisinde, lipazların spesifitelerine bağlı olarak hem sulu hem de organik sistemlerde çeşitli reaksiyonlardaki gereksinimleri dolayısıyla potansiyel güçleri anlaşılmıştır. ( Tablo 2 )
,
Tablo 2 : Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamalardaki önemli alanları
Endüstri Etki şekli Ürün
Unlu mamüller Aroma geliştirme ve Unlu mamüller
raf ömrünün uzatılması
Meşrubat Aroma geliştirme Meşrubatlar
Kimyasal Asimetrik sentez (ee) Şiral yapı blokları ve kimyasallar
Kozmetik Sentez Emülsifiye edici ve
nemlendirici maddeler
Süt ürünleri Süt yağının hidrolizi Aromatik maddeler
Peynir olgunlaştırma Peynir
Tereyağı modifikasyonu Tereyağı
Katı-sıvı yağlar Transesterifikasyon Bitkisel yağ, margarin
Hidroliz Yağ asitleri, gliserol
mono ve digliseridler
Gıda terbiyesi Kalite geliştirme Mayonez, salça
Sağlıklı gıda Transesterifikasyon Sağlıklı gıda
Deri Hidroliz Deri ürünleri
Et-balık Aroma geliştirme ve Et ve balık ürünleri
yağın uzaklaştırılması
Kağıt Hidroliz Kağıt ürünleri
İlaç Transesterifikasyon Özellikli lipidler
Hidroliz Sindirime yardımcı ürünler
'''Süt Ürünleri Endüstrisinde Lipazlar'''
Lipazlar, süt yağının hidrolizi için süt ürünleri endüstrisinde geniş surette kullanılmaktadır. Günümüz uygulamaları, peynir aromasının artırılması, peynir olgunlaşmasının hızlandırılması, peynir benzeri ürünlerin imalatı ve kaymak hidrolizi işlemlerini içermektedir. Oysa, lipazların ilavesi öncelikle kısa zincirli ( C4 ve C6 ) yağ asitlerinin uzaklaştırılmasıyla keskin ve hoş aromanın gelişmesine yol açar; orta zincirli ( C12 ve C 14 ) yağ asitlerinin uzaklaştırılması ise üründe sabunumsu bir tat oluşumuna yol açmaktadır. Katkı içeriğinde, serbest yağ asitleri, aseto asetat, ß-keto asitleri, metil ketonları, aroma asitleri ve laktonlar gibi diğer aroma içeriklerinin sentezini başlatan basit kimyasal reaksiyonların yerini almaktadır.
Daha geçenlerde, Mucor miehei, Aspergillus niger ve A. oryzae gibi tamamen bir dizi mikrobiyal lipazlardan hazırlanmış preparatlar peynir imalatı endüstrisi için geliştirilmektedir. Bir dizi iyi kalite peynir sadece mikrobiyal lipazların veya çeşitli preparatlarının karışımlarının kullanımıyla üretilmiştir. Koyun veya keçi sütünden yapılan peynirlerin taklidi için geniş ölçüde lipazlar kullanılmaktadır. İnek sütüne lipaz ilavesi, koyun veya keçi sütünden elde edilen aromaya benzer bir aroma üretir. Bu, peynir üretimi için kullanılmaktadır ve böylece enzimle modifiye edilmiş peynir (EMP) olarak adlandırılmaktadır. EMP; soslar, çorbalar ve çerezler gibi diğer ürünlerde bir katkı maddesi olarak kullanılmak üzere konsantre aroma üretiminde yükseltilmiş sıcaklıklarda enzim varlığında inkübe edilen bir peynirdir.
'''Deterjanlarda Lipazlar'''
Yıkama tozlarında enzimlerin kullanımı hala endüstriyel enzimler için tek büyük pazar olmayı sürdürmektedir. Dünya çapında, evlerde kullanılan deterjan formulasyonu için daha düşük çamaşır yıkama sıcaklıklarına yönelme, taleplerin oldukça artmasına sebep olmuştur. Son günlerdeki, Novo Nordisk’in lipolazı ( Aspergillus oryzae’de tanımlanan Humicola lipazı) gibi genetik manipülasyonların yer aldığı çeşitli preparasyonlar yoğun koruma programlarında tanıtım imkanı bulmuştur.
'''Oleokimyasal Endüstrisinde Lipazlar'''
Enerji biriktirdiği ve hidroliz, gliseroliz ve alkoliz reaksiyonları sırasında sıcaklık derecelerini en aza indirdiği için, lipazların oleokimyasal endüstrisinde uygulama sahası çok büyüktür. Japon Miyoshi Yağ şirketi, sabun üretiminde Candida cylindracea lipazının ticari bir şekilde kullanıldığını bildirmiştir. Yeni nesil ucuz ve sıcaklığa daha dayanıklı enzimlerin tanıtımı, ekonomik dengeyi lipaz kullanımının lehine değiştirebilir.
Oleokimyasal endüstrisinde bugünkü eğilim, organik çözücüler ve emülsifiyerlerin kullanımından uzaklaşma yönündedir. Hidroliz, alkoliz ve gliseroliz reaksiyonlarını içeren çeşitli reaksiyonlar, doğrudan karışık substratlar üzerinde bir dizi immobilize olmuş lipazların kullanımıyla gerçekleştirilmektedir. Bunun sonucu olarak da proses sürekli işlediği için yüksek verim elde edilmektedir. Enzimatik hidrolizler, fazla miktarda termal enerji masrafı gibi pahalı ekipman yapılan büyük yatırımlar olmaksızın, yağ ayrıştırma işlemlerinde başarılı olacağı şeklinde en büyük umudu vaat etmektedir.
'''Trigliseridlerin Sentezinde Lipazlar'''
Yağların ticari değeri, yapılarındaki yağ asitlerinin düzenlenişine bağlıdır. Bitkisel yağ, çok kıymetli asimetrik trigliserid karışımına tipik bir örnektir. Unilever ve Fuji Yağ Şirketleri, bitkisel yağ yerine kullanılan maddelerin imalatı için 1,3-rejiyospesifik lipazların potansiyellerini açıkça belirtmiştir. Ürün düzenlenişinin analizinin de yer aldığı bu teknoloji üzerinde kapsamlı görüşler mevcuttur. Esas itibariyle, insan sütü yağı gibi değerli diyetik veya besleyici özelliklere sahip olan farklı yapıda diğer bir çok trigliseridlerin sentezi için de aynı yaklaşım uygulanabilmektedir. Bu trigliseridler ve fonksiyonel olarak benzer yağlar, 2-palmitoyl gliserid ile doymamış yağ asitlerince zengin olan palmiye yağı fraksiyonlarının asidolizi ile kolaylıkla elde edilmektedir. 1,3-spesifik lipazlar tarafından katalizlenen asidoliz reaksiyonları, genellikle orta zincirli yağ asitlerini içeren besleyici yönden önemli ürünlerin hazırlanmasında kullanılmaktadır. Araşidonik asit, eikosapentaenoik asit ve dokohekzaenoik asitler gibi oldukça değerli çoklu doymamış yağ asitleri bakımından zengin olan yağların modifikasyonu hususunda lipazlar geniş surette incelenmektedir. Monogliserid fraksiyonlarını içeren çoklu doymamış yağ asitlerindeki mevcut zenginlik, lipazların katalizlediği alkoliz veya hidroliz işlemleriyle başarılmaktadır.
'''Yüzey Aktif Maddelerin Sentezinde Lipazlar'''
Poligliserol ve karbohidrat yağ asitleri esterleri, endüstriyel deterjanlarda ve çok çeşitli gıda formulasyonlarında emülsifiye edici maddeler olarak geniş ölçüde kullanılmaktadır. Fonksiyonel olarak yüzey aktif maddelere benzeyen enzimatik sentezler, mükemmel rejiyoselektivite ile ılık sıcaklıklarda (60-80 C) gerçekleştirilmektedir. Adelhorst et al. tarafından çözücü olmaksızın erimiş yağ asitleri ve immobilize Candida artarctica lipazını kullanarak basit alkil-glikozidlerin esterfikasyonunu gerçekleştirilmiştir. Fregapane et al, başlangıç materyali olarak şeker asetallerinin kullanımıyla monosakkaritlerin mono- ve diesterlerinden yüksek kazanç elde etmiştir. A. terreus lipazı, doğal yağlarla şeker alkolleri arasında gerçekleştirdiği transesterifikasyon reaksiyonuyla biyolojik bir yüzey aktif madde sentezlemektedir. Lipazlar ayrıca lizofosfolipidlerin üretiminde fosfolipazların yerine geçebilirler. Mucor miehei lipazı bir dizi primer ve sekonder alkollerin içerisinde fosfolipidin transesterifikasyonu için kullanılmaktadır. Lipazlar ayrıca, amino asit bazlı esterler ve amidler olarak adlandırılan bütün bir dizi biyolojik parçalama yapan amfoterik yüzey aktif maddelerin sentezinde de kullanılmaktadır.
'''Kişisel bakım ürünleri içeriğini oluşturan maddelerin sentezinde lipazlar'''
Geçtiğimiz günlerde Unichem Uluslararası Şirketi cilt ve güneş yanığı kremleri ve banyo losyonları gibi kişisel bakım ürünlerinden emollient olarak kullanmak için isopropil miristat, isopropil palmitat ve 2-etilhekzil palmitat üretimine başlamıştır. Balmumu esterleri de kişisel bakım ürünlerinde benzer uygulamaya sahiptir ve kesikli bir biyoreaktör içerisinde C. cylindracea lipazının kullanımıyla enzimatik yolla imal edilmektedir.
'''İlaç Sanayisinde ve Tarım Kimyasallarında (Agrokimyasallar) Lipazlar'''
Şiral ilaçların hazırlanmasında lipazların faydası oldukça iyi bilinmektedir ve belgelendirilmiştir. Sainz- Diaz et al. ve Davis et al. tarafından tanımlanan çeşitli proseslerin kısa bir süre önce ticari kullanımı başlamıştır. Fenoksipropiyonat herbisitlerin sentezi için başlangıç materyalleri olan 2-halopropiyonik asitlerin çözümlenmesi (S) izomer lerinin bütanolle, porsin pankreatik lipazının anhidröz hekzan içerisinde katalizlenen selektif esterifikasyonuna dayalı bir işlemdir .Lipazların rasemik karışılmalın içerisinde çözünmelerinde ticari uygulamasının etkileyici diğer bir örneği de epoksi ester alkollerinin hidrolizidir. Reaksiyon ürünleri, (R)-glisidil esterleri ve (R)-glisidol, optik bakımdan aktif ß blokçuların ve geniş bir dizi diğer ürünlerin hazırlanması için daha cazip aracılar olan (R)- ve (S)- glisidiltosilatlara kolaylıkla dönüştürülmektedir. benzer bir teknoloji, optikçe saf kardiyovasküler ilacı olan Diltiazem’in imalatında anahtar aracı olan 2(R), 3(S)-metilmetoksifenil glisidatın ticari üretiminde kullanılmaktadır.
Lipazlar, bazı prostaglandinlerin, steroidlerin ve karboksilik nükleosit analoglarının hazırlanmasında rasemik alkollerin çözümlenmesi için endüstriyel katalizörler olarak uygulamalara sahiptir. Çok fonksiyonlu organik bileşiklerin rejiyoselektif modifikasyonu, özellikle AIDS tedavisi alanında, lipaz uygulamasının yine süratle genişleyen diğer bir alanıdır. A. carneus ve A. terreus lipazları ilaç sanayisinde önemli olan polifenolik bileşiklerin perasetatlarının hidrolizinde kemo- ve rejiyospesifite göstermektedir. lipazlar ayrıca okta-asetil sukrozun rejiyoselektif hidrolizi ile yapay tatlandırıcı olan sukralozun sentezinde de kullanılmaktadır.
'''Polimer Sentezlerinde Lipazlar'''
Optikçe aktif polimerlerin sentezi için lipazların stereoselektivitesi kullanılmaktadır. Bu polimerler asimetrik ayıraçlardır ve emiciler olarak kullanılmaktadır. Sıvı kristallerin çalışma sahasında çözülerek rasemik alkollere eşlik edebilen alkollerin lipazlar tarafından katalizlenen transesterifikasyonu ile uygun monomerler hazırlanabilir. Ayrıca ferroelektrik sıvı kristallerin hazırlanması için şiral glisidil tosilatların kullanıldığı bildirilmiştir. Bu yüzden, bu enzim hem ölçüm hem de proses dönemlerinde çeşitli ticari kullanımlara sahiptir. Lipazlar, iyi kimyasalların ve farmasötiklerin yüksek teknolojik üretimlerinde olduğu kadar gıda endüstrisinde de başarılı bir şekilde görev almaktadır. Üstelik, bu enzimin daha yeni alanlarda potansiyelleri mevcuttur, örneğin kağıt imalatnda lipazlar başarılı bir şekilde kullanılmaktadır; görünüşe göre, kağıt hamurunun lipaz ile muamele edilmesi daha yüksek kalitede ürün oluşumuna ve azaltılmış temizleme ihtiyacına yol açar. Benzer bir şekilde, enzim, bir dondurma tesisinden yağca zengin akıntı haldeki maddelerin işlenmesi için mikrobiyal bir kokteyl ile toplanmalarında kullanılmaktadır. Bu, ayrıca bir çok gıda endüstrisinin atık maddelerinin işlenmesinde de kullanılabilir.
'''Hindistan’da Lipaz Araştırmalarının Son Durumu'''
Hindistan’da koruma üzerine çok az sayıda raporun olduğu ve az miktarda mantar ve bakteride görülen lipaz üretiminin olduğu 1970’li yılların sonuna doğru mikrobiyal lipazlar üzerine araştırmalar yapılmıştır. Burada en önemli nokta, maksimum lipaz üretimi için korumanın proses optimizasyonu ile takip edilmesidir. Ulusal Süt Ürünleri Araştırma Enstitüsü’nde bilim adamları, Karnal, M. racemosus, A. wentii ve P. crysogenum tarafından üretilen lipazların fiziko-kimyasal durumlarını incelemiştir. 1981 yılında, pirinç-saman bileşiminin termofilik mantarının lipolitik aktivitesi bir grup tarafından aydınlatılmıştır. Sistematik koruma stratejileri Bhaduria tarafından kullanılmıştır. Bu çalışma, şironji ve ceviz özlerinden izole edilen A. niger, A. flavus ve Penicillium glaucum’un potansiyel lipaz üreticileri olukları bildirilmiştir.
Lipazların endüstriyel uygulamaları sayesinde, Yeni Delhi’de Biyoteknoloji Bölümü’nde bu önemli alanda araştırma çalışmaları desteklenmektedir ve bundan dolayı Hindistan’da lipazlar üzerine yapılan araştırmalar hızla gelişmektedir. Biz, A. terreus, A. carneus ve B. stearothermophylus’u kullanarak lipaz üretimi için geniş ölçülü proses optimizasyonunu gerçekleştirdik. Chakrabarty et al., kimyasal interesterifikasyonla elde edilemeyen şekil değişikliğine uğramış yenilebilir değerli yağların üretimi için transesterifikasyon reaksiyonlarında hücre dışı mikrobiyal lipazları kullanılmıştır.Chand et al. kastor-fasülye lipazını kullanarak yağ ayrıştırmayı başarmıştır. H. lanuginosa ve Y. lipolytica lipazları ayrıca geranil esterlerin sentezi için kullanılmaktadır. Kundu et al. N. crassa’nın konidiyasında 54kDa ve 27kDa moleküler ağırlığında görünen bir hücre dışı lipazını izole ve karakterize etmiştir, jel filtrasyon ve SDS-PAGE yöntemleriyle tespit etmiştir, o suretle tanımlana iki alt birimin varlığı fikri akla gelmiştir.
1988’den beri, üretim ve saflaştırmadan başlayarak karakterizasyon ve endüstriyel uygulamalara kadar lipaz araştırmalarının çeşitli yönleri üzerindeki yoğun çalışmalar, Delhi Üniversitesi’nin Güney Kampüsü’nde çeşitli mantarlar ve bakteriler üzerinde gerçekleştirilmektedir. A. terreus ve A. carneus’un yeni, sıcaklığa dayanıklı ve alkalin lipazlar, biyolojik aktif maddelerin, gliseridlerin ve ilaç sanayisinde önemli bileşiklerin üretimi için geliştirilmektedir. Bu lipazlar, yeni bir tarzda polifenolik bileşiklerin rejiyo- ve kemoselektif bölünmesini göstermektedir. Diğer yandan, bu alanda araştırmacıların çokça kullandığı hızlı bir zimogram, poliakrilamid jelde lipaz aktivitesi için geliştirilmiştir.
Lipazların organik çözücülerdeki artmış stabilite ve selektivite gösterme yetenekleri çeşitli araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır Parmer et al.., Hindistan Delhi’de Teknoloji Enstitüsü’nde Gupta, Qazi ve grubu ve SPIC Bilim Vakfı. Parmer et al. tarafından ticari lipazların kullanımıyla poliasetoksi arilmetil ketonların , benzilfenilketon perasetatların, aromatik poliasetooksi asitlerinin esterlerinin ve perasetillenmiş benzopiranonların üzerinde biyotransformasyon yapmayı başarmıştır. Qazi ve grubu rasemik ilaçların çözümlenmesi için mikrobiyal lipazların enantiyoselektif davranışlarını kullanılmaktadır. Gupta ve grubu organik çözücüler içerisinde enzim aktivitesini incelemektedir. Onlar, sulu-organik çözücül karışımı içerisinde de enzim aktivitesinin arttığını ifade etmişlerdir.sridhar et al., seçilmiş Hindistan sebze yağlarının bitkisel yağ yerine kullanılan maddelerin ve yüksek oleik yağların modifikasyonu için lipazların katalizlediği ester değiş-tokuşun kullanmıştır. Satyanarayana ve Johri, Sharath ve Kamat ve SPIC Anna Üniversitesi Biyoproses Laboratvarı’ndaki bilim adamları, henüz ticari düzeyde kullanılmayan yeni mikrobiyal lipazların üretimi üzerinde çalışmaya başlamışlardır. Madras’ta Merkezi Deri Araştırma Enstitüsü’nde ve Misori’deki Merkezi Gıda Teknolojileri Araştırma Enstitüsü’ndeki bilim adamları sırasıyla, deri işlenmesinde ve lezzetli esterlerin üretiminde mikrobiyal lipazları kullanmaktadırlar.
Hindistan laboratuarlarında yürütülen çalışmalar, hatırı sayılır bir biçimde gelişmeye sahiptir. Zamanla, endüstriyel uygulamalarda ticari düzeyde kullanmak için seçilen, kemo- , rejiyo- ve enantiyoselektivite özellikleri olan yeni lipazlar izole edilmektedir. Bundan başka, lipaz üretimi için geliştirilen bazı yerel teknolojiler daha şimdiden ticari üretim aşamasına geçmiştir. Üstelik, bu şekilde üretilen lipazlar ile bilinen ticari yönden değerli olan lipazlar karşılaştırıldıklarında, ikisinin biribirine eşit olduğu veya yerel yöntemlerle üretilen lipazların daha iyi oldukları görülmüştür. Bu nedenle, 21. yüzyıla girerken bu lipazların kullanımı biyoteknolojiye dayalı pek çok endüstriye önemli ölçüde yardımcı olacaktır.
'''Sonuç'''
Lipazlar, hem sulu hem de susuz ortamlarda yapılması güç reaksiyonları başarabilen en önemli biyokatalizörler arasında yer almaktadırlar. Lipazlar, çok çeşitli kemo-, rejiyo- ve enantiyoselektif transformasyonları başarıyla gerçekleştiren olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Bu nedenle lipazlar, organik kimyacıların malzeme seçeneğidir. Lipazların, genellikle kolay elde edilmeleri, sınırsız substrat toleransları, yüksek sıcaklıklara ve organik çözücülere karşı dayanıklılığı, yüksek enantiyoselektivitesi ve ticari şekilde uygulanabilirliği gibi özelliklerinin hepsi, onların, organik kimyacılar arasındaki yaygın popülaritesini kazanmasına sebep olur. Günümüzde, lipazlar endüstriyel mikrobiyoloji ve biyoteknolojinin çeşitli alanlarında çok geniş uygulamalara sahiptir. Bu durum, son beş on yılda elde edilen çok büyük sayılardaki araştırma incelemelerinin sonucu belgelendirilmiştir. Lipazlar, katalitik davranışlarına bağlı olarak muazzam bir şekilde çok yönlülük göstermektedir. Bu yüzden, istenen şekilde selektivite ve substrat toleransına sahip daha yeni lipazlar için birçok çalışma alanı bulunmaktadır.
Lipazların daha geniş düzeyde kullanımları için, katalizledikleri reaksiyonların arkasındaki mekanizmayı anlamak acil bir ihtiyaç olarak görülmektedir. Lipazların arabirimlerdeki eşsiz aktivasyonları her zaman enzimolojistleri kendine hayran bırakmaktadır, ve geçenlerde de, biyofizikçiler ve kristallograflar bu enzimlerin yapı-fonksiyon ilişkilerinin anlaşılmasında ilerleme kaydetmişlerdir. Bununla birlikte, lipaz moleküllerinin tamamen anlaşılması için çok fazla araştırma çabası gerekmektedir.
{{biyokimya-taslak}}
[[ru:Липаза]]
[[sv:Lipas]]
{{düzenle|Ocak 2007}}
|
