Kullanıcı:Universal Life/Çalışma Odası/Quantification of the Retrotransposon BARE-1 Reveals the Dynamic Nature of the Barley Genome

Quantification of the Retrotransposon BARE-1 Reveals the Dynamic Nature of the Barley Genome, by Soleimani et al.

Résumé

• BARE-1 kopya sayısını nicelemek için qRT-PCR kullanmışlar.
• 5 cultivar'da ve de yabani bir türde yapmışlar.
• BARE-1'in, LTR-içi bölgelerini ve de RT genini çoğaltmak amacıyla 2 set PCR primeri kullanılmıştır.
• LTR primerleri haploid genom başına, yaklaşık, 214.800 kopya belirlemiştir.
• RT primerleri ise, yaklaşık, 15.580 kopya belirlemiştir. Oran (13,5:1)
• Bu bulgular şu sonuçları belirtmektedir:
  • Arpa genomunun % 7'si solo-LTR'ler halindeki BARE-1'lerden,
  • % 2,6'sı da tam-boy BARE-1'lerden oluşmaktadır.
  • Toplamda, BARE-1'ler, arpa genomunun % 9,6'sını oluşturmaktadırlar.

Introduction

• Retrotranspozonlar şöyledir, böyledir...
• Önemli bir nokta: (aklıma getirdi)

Transpozonlar, "copy-paste" transpozisyonu ve de elementler-arası ve element-içi rökombinezonlar yoluyla genom boyutunu değiştirmekte, genomu yeniden şekillendirmekte böylece gen ekspresyonlarını "mütasyon", "epimütasyon" ya da "transkripsyon faktörlerinin ulaşabilirliğini etkileyerek" değiştirmektedir. C-değer paradoksu da bu yolla ortaya çıkmaktadır.

• Main contributors are LTRs and LINEs.
• Kopya sayısı teknikleri genelde hibridizasyon teknikleri kullanılarak yapılır. Ancak, sonuçlar kesin olmaz.
• Alternatif olarak, SYBR green- qRT-PCR veya FRET-TaqMan-qRT-PCR uygulanır.

metaryel ve metod

Plant material

Nerelerden aldıkları ve tipi

DNA eldesi

• Kallustan değil
• 1 haftalık doku kültürü yapraklarından...

Réflechissements

1. BARE-1 Retrotranspozonu'nun hem RT geni var hem de LTR dizileri var.
2. Bu ikisinden de primer dizayn ediliyor.
3. Normal PCR + Agaroz Jel sonucu = hem LTR hem RT'den birer bant elde ediliyor.
4. pDrive denen bir vektör kullanılarak E. coliler transforme ediliyor. (Niye?)
5. Ampisilinle kontrol, ardından rökombinelerden plazmid izolasyonu, tekrar PCR ve ardından dizi analizi, BLAST ile tekrar kontrol. (ne zahmet ya)
6. pDrive klonlama vektörünün, polylinker bölgesinde bulunan RT ve LTR domenleri, qRT-PCR için "dış standart" ve bunu plazmidden hazırlıyorlar.
   • İzolasyon +
   • Linearizasyon ve kesim için "restriksyon endonükleazları"
7. Ardından gene bin bir hazırlık...
8. PCRs for both the standards and the unknown samples were prepared from the same master mixture using ... SYBR Green I.
9. vs.. Floresans her adımda ölçülüyor...
10. SONUÇLAR

Standard & melting curves

For reliable quantification, the amplification efficiency during PCR must be equal between the standards and the unknown.

Réflechissements (devam)

Burada TE'lerin, özellikle retrotranspozonların öneminden bahsediyor. Özellikle;

1. Genom mimarisi ve evriminde,
2. Genomdaki aktif elementlerin sayıca artmasında önemliler.
3. Mısır genomunun yarısı, ve diğer bitkilerde de benzer...

2 önemli mekanizma, retrotranspozonların genom-boyutuna etkilerinin ortaya çıkmasında rol oynuyor.

1. Transpozisyonun regülasyon ve(ya) süpresyonu
2. Retrotranspozon-aracılı rökombinezon;
   • Bu da genom boyu kısalmasını ve de solo LTRleri açıklıyor.

Retrotransposition ≠ Recombination: Counteracting forces

• Epigenetik bir fonksyona da değiniliyor: LTR sekansları "promotor" veya "enhancer" gibi davranarak"adjacent gen"lerin ifadelerini ortaya çıkartabilir.